本文關(guān)鍵詞：延胡索酸水合酶（FH）和甲基化CpG結(jié)合蛋白1（MBD1）的多抗制備及其功能研究

  更多相關(guān)文章： 延胡索酸水合酶 多克隆抗體 免疫印跡 免疫共沉淀 甲基化CpG結(jié)合蛋白1

【摘要】：目的：構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2/FH(400-510),轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達GST-FH(400-510)融合蛋白。以純化的融合蛋白作為抗原免疫小鼠獲得抗人FH抗體。免疫印跡驗證該抗體的特異性并分析FH在腦、心和肝臟組織中的分布。通過免疫共沉淀實驗研究FH的相互作用蛋白。構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2/MBD1(383-455), pMAL-C5X/MBD1(227-300), pMAL-C5X/MBD1(1-70)并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達融合蛋白,以純化融合蛋白作為抗原免疫小鼠獲得抗小鼠MBD1抗體。免疫印跡驗證該抗體的特異性,免疫共沉淀實驗證明抗體的功能。 方法：(1)人FH蛋白片段的表達、純化和多抗制備。軟件分析人源FH基因,選擇1200-1530bp位的堿基序列為目的基因,其編碼的110個氨基酸具有很好的同源性和抗原性。以PCMV6-AC/FH為模版PCR擴增目的基因,將目的基因克隆至表達載體pGEX-4T-2,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-2/FH(400-510).重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測序鑒定后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達。將誘導(dǎo)后的菌株進行破碎離心分離上清和沉淀,SDS-PAGE分析蛋白的存在狀態(tài)。將上清用GST瓊脂糖凝膠親和層析純化；沉淀采用8M的尿素變性、透析復(fù)性后用GST瓊脂糖凝膠親和層析純化。SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定純化蛋白,并用Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。用純化的蛋白免疫小鼠,制備抗血清。 (2)驗證抗體功能和尋找FH的相互作用蛋白。通過免疫印跡實驗證明了該抗體的特異性并分析FH在大鼠的腦、心和肝組織中的分布情況。用自制抗體與小鼠的肝臟組織進行免疫共沉淀實驗尋找FH的相互作用蛋白。將獲得的蛋白進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。 (3)小鼠MBD1蛋白片段的表達純化和多抗制備。依據(jù)MBD1結(jié)構(gòu)分析選擇MBD1的1-70aa、227-300aa、383-455aa三段肽段為抗原肽段。以PCMV6-AC/MBD1為模版,PCR獲得三段目的基因。將目的基因分別克隆至表達載體pGEX-4T-2和pMAL-C5X上構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-2/MBD1(383-455)、pMAL-C5X/MBD1(227-300)和pMAL-C5X/MBD1(1-70)。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和測序鑒定后,再轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達。親和層析純化融合蛋白并用western blot驗證。將純化的融合蛋白進行SDS-PAGE,經(jīng)考馬斯亮藍染色后,將目標蛋白條帶切膠研碎與免疫佐劑共同免疫小鼠獲得抗小鼠MBD1抗血清。將自制的抗血清通過western blot法分別識別人源和鼠源的MBD1,同時與小鼠的腦組織進行免疫共沉淀實驗驗證抗體的功能。 結(jié)果：(1)PCR擴增獲得330bp的FH(400-510)目的基因,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-2/FH(400-510),經(jīng)測序和PCR證實成功插入了目的基因。含pGEX-4T-2/FH(400-510)的DE3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)親和純化獲得融合蛋白GST-FH(400-510)。western blot驗證純化目標蛋白能被抗GST抗體識別,在分子量36KD處有特異性條帶與預(yù)期的蛋白分子量相符。重組融合蛋白免疫小鼠獲得抗FH抗體。 (2)Western-blot結(jié)果顯示,大鼠來源的FH內(nèi)源性蛋白能被自制的抗FH抗體識別,在55kDa附近有特異條帶。FH在大鼠的心臟和肝臟中的含量遠高于腦。質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn),FH的相互作用蛋白主要是一些參與三羧酸循環(huán)的酶及參與尿素循環(huán)的酶、線粒體上的轉(zhuǎn)運載體蛋白和與細胞生長、遷移相關(guān)的蛋白。 (3)PCR擴增獲得三段MBD1目的基因約210bp,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-2/MBD1(383-455), pMAL-C5X/MBD1(227-300),pMAL-C5X/MBD1(1-70),經(jīng)測序和PCR證實成功插入了目的基因。含重組質(zhì)粒的的DE3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)親和純化獲得融合蛋白GST-MBD1(383-455),MBP-MBD1(227-300), MBP-MBD1(1-70)。SDS-PAGE和Western-blot驗證GST-MBD1(383-455)融合蛋白,在36kD特異條帶與預(yù)期融合蛋白大小一致。在26KD附近存在一條帶與GST標簽大小一致。SDS-PAGE和Western-blot驗證MBP-MBD1(227-300), MBP-MBD1(1-70)融合蛋白,在50KD附近有特異條帶與預(yù)期融合蛋白大小一致。Western-blot結(jié)果顯示：以MBP-MBD1(227-300)和GST-MBD1(383-455)為抗原制備的抗體能夠識別人和鼠的MBD1,并且能夠進行免疫共沉淀實驗。 結(jié)論： (1)成功的構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒,表達純化得到了FH的融合蛋白GST-FH(400-510)和融合蛋白MBP-MBD1(227-300), MBP-MBD1(1-70), GST-MBD1(383-455)。 (2)表達純化的融合蛋白能夠刺激小鼠產(chǎn)生抗FH的和抗MBD1的多克隆抗體。 (3)制備的抗鼠的MBD1抗體能夠很好的識別鼠源和人源的MBD1并能夠應(yīng)用于免疫共沉淀實驗。 (4)FH大鼠的心臟和肝臟中含量比腦組織高。 (5)發(fā)現(xiàn)多個三羧酸循環(huán)和尿素循環(huán)中的酶可能與FH發(fā)生相互作用。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 白雪;李世擁;于波;安萍;蔡慧云;;結(jié)直腸癌原發(fā)灶和正常腸黏膜組織相關(guān)差異表達蛋白研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

2 王波;侯松濤;陳露露;劉婷婷;;延胡索酸酶的結(jié)構(gòu)和功能研究進展[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(下半月刊);2009年14期

3 況鵬;李雪飛;李冰;王永生;李嘉瑜;周彩存;;人肺腺癌細胞株A549和A549/DDP的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J];腫瘤;2012年03期

4 宋軍;單雪芹;韓先干;劉佩紅;孫曉慶;潘玲;丁鏟;于圣青;;布魯氏菌延胡索酸水合酶與纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原的結(jié)合活性[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2013年01期

，

本文編號：1158729