本文關(guān)鍵詞：降鈣素基因相關(guān)肽促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及其相關(guān)機(jī)制的初步研究

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【摘要】：由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨缺損、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學(xué)難題。對于如何從根本上提高其治療效果,明確骨再生、重建、塑形的病理生理學(xué)特點(diǎn)及其相關(guān)生物學(xué)作用機(jī)制是其基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。骨組織是一種伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)礦化、可以根據(jù)需要不斷進(jìn)行自我修復(fù)的復(fù)雜動態(tài)組織,亦是帶有血管、神經(jīng)支配的生物活性組織,因此,骨折修復(fù)的過程中既與人體內(nèi)多種組織、細(xì)胞因子之間錯綜復(fù)雜的協(xié)同作用相關(guān),也與骨組織的血液供應(yīng)、神經(jīng)支配緊密相關(guān),因此重建修復(fù)區(qū)域內(nèi)環(huán)境生物學(xué)的穩(wěn)定性,尤其是重建血液供應(yīng)和神經(jīng)支配是關(guān)鍵步驟。血液供應(yīng)的恢復(fù)對于保障骨組織及移植物生物學(xué)活性的重要性已經(jīng)被許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐所證實(shí),除此之外,神經(jīng)因素可能在骨組織再生過程中同樣發(fā)揮著重要作用。 骨骼是一種可根據(jù)需要不斷修復(fù)的生物活性組織,骨再生和骨重建是一個復(fù)雜的持續(xù)的動態(tài)過程,受體液和生物動力學(xué)等多種因素共同調(diào)節(jié),尤其是與血液供應(yīng)和神經(jīng)支配密切相關(guān)。早已有學(xué)者們通過解剖學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)骨組織中存在著大量神經(jīng)纖維,這些神經(jīng)纖維多圍繞血管周圍并與之伴行,分布于骨膜、骨表明及骨髓等活躍區(qū)域。隨著研究的深入,已經(jīng)證實(shí),骨組織的神經(jīng)纖維為肽能神經(jīng),可分泌多種神經(jīng)肽參與調(diào)控多種生理功能,降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是具有代表性的神經(jīng)肽之一。降鈣素基因相關(guān)肽(calcilonin gene-related peptide, CGRP)是一種含有37個氨基酸的生物活性多肽,由降鈣素基因組織特異性選擇性剪接所產(chǎn)生,廣泛分布于中樞系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)及某些器官組織當(dāng)中,參與和調(diào)節(jié)多種重要功能。CGRP是周圍神經(jīng)中含量最多的一種神經(jīng)肽,也是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管擴(kuò)張肽,具有很強(qiáng)的血管擴(kuò)張作用。研究證實(shí)CGRP在骨修復(fù)及重建過程中具有重要作用,降鈣素基因相關(guān)肽免疫反應(yīng)神經(jīng)纖維的出現(xiàn)與血管相關(guān),并且和骨組織中的骨髓細(xì)胞,骨細(xì)胞和其它細(xì)胞均有相關(guān)性。這些神經(jīng)纖維經(jīng)常以串珠狀、類似靜脈曲張的外觀出現(xiàn)。CGRP免疫陽性神經(jīng)纖維廣泛分布于骨膜、骨髓腔、干骺端等處。CGRP可能具有多種功能,可以作為神經(jīng)遞質(zhì),血管擴(kuò)張劑和神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)器發(fā)揮作用。CGRP可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而促使血管形成,從而增加局部的血流。有研究表明,骨折患者的血漿中,CGRP濃度明顯增加,骨折局部CGRP陽性神經(jīng)纖維數(shù)量也明顯增加。腦外傷患者骨折愈合速度較普通骨折患者快,且與血漿中高濃度CGRP相關(guān)。因此推測CGRP可能通過軸漿運(yùn)輸?shù)焦钦劬植?擴(kuò)張局部血管,增加骨折局部的血液供應(yīng),從而促進(jìn)骨折愈合。Aoki等學(xué)者的研究也證實(shí),在大鼠脛骨骨折模型中,骨折愈合時,骨膜、新生骨組織和纖維肉芽組織之中出現(xiàn)許多CGRP陽性神經(jīng)纖維,且多數(shù)位于血管附近,這些感覺神經(jīng)纖維可以在局部釋放出明顯高于血清水平的CGRP,參與骨折愈合過程。 血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛分布在血管內(nèi)壁,是血管內(nèi)壁的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)骨組織具有高度血管化,在骨中,血管內(nèi)皮位于骨髓的毛細(xì)血管腔壁內(nèi),與骨細(xì)胞、骨周圍神經(jīng)都存在著緊密的聯(lián)系。血管化在骨修復(fù)和重建過程中發(fā)揮重要作用,血管形成是骨形成、再生、重塑的基礎(chǔ),在骨再生過程中,血管的形成要明顯早于骨的形成,血管可以向組織器官提供氧氣,輸送營養(yǎng)物質(zhì)等,并可分泌多種生長因子,包括BMP、VEGF、OPG、IGF-1、bFGF、CO等,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化,以促進(jìn)成骨；同時抑制破骨細(xì)胞的活性,阻止其骨吸收作用；還可通過VEGF等直接作用于血管,影響新生血管的形成,進(jìn)而調(diào)節(jié)骨的修復(fù)。血管生成能恢復(fù)骨折區(qū)域的血運(yùn),并能產(chǎn)生相關(guān)生長因子以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性,聚集干細(xì)胞、定向分化成骨細(xì)胞以促進(jìn)骨形成。而血管內(nèi)皮細(xì)胞基膜的降解、增殖和遷移是新血管形成所必需的前提條件,成為骨修復(fù)的關(guān)鍵步驟。 前期研究發(fā)現(xiàn),CGRP可作為局部刺激因素刺激HUVECs增殖,CGRP對HUVECs的增殖作用具有時間-濃度依賴性。且在10-8mol/L作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了更加深入的研究,不僅從正向進(jìn)一步證實(shí)CGRP對HUVECs具有明顯的促增殖作用,而且還加入了CGRP拮抗劑CGRP8-37及MAPK通路相關(guān)蛋白拮抗劑同時從反向驗(yàn)證此效應(yīng),并從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面,對其具體作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。 研究目的 ●進(jìn)一步明確神經(jīng)肽CGRP促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖的作用。 ●從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度,初步探討神經(jīng)肽CGRP在HUVECs促增殖作用中的生物學(xué)機(jī)制。 第1部分人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的獲取和鑒定 目的： 獲取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),對細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物(Ⅷ因子)進(jìn)行免疫熒光鑒定,并用其作為種子細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步相關(guān)研究。 方法： 獲取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 新生兒剖宮產(chǎn)臍帶離體2h以內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),長度大約22cm。以連接有50mL注射器的7號輸液針頭斜行插入臍靜脈內(nèi),然后以鑷子固定針頭,用含肝素的PBS液沖洗臍靜脈內(nèi)血液,直至液體顏色清亮,將臍靜脈內(nèi)多余的PBS液擠壓出。使用鉗子夾閉臍帶兩端,由針筒緩慢注入0.1%Ⅰ型膠原酶溶液至靜脈充盈,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中消化20min。消化后用止血鉗擠壓揉搓臍帶外壁,使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。收集消化液,并以含肝素的PBS液沖洗臍靜脈2-3次；收集沖洗液,以離心半徑15cm、800r/min離心10min后棄上清,加入EGM培養(yǎng)基,種植于1%明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48h后全量換液,此后每3天換液1次,細(xì)胞融合達(dá)80%后消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 鑒定人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 用第1代細(xì)胞行vWF免疫熒光鑒定。待細(xì)胞在蓋玻片上生長融合為單層后,4%多聚甲醛固定30min,正常山羊血清封閉30min;加入兔抗vWF抗體,置于濕盒中4℃過夜；加入DyLight594標(biāo)記的山羊抗兔IgG,置于37℃中30min；以5μg/mL DAPI染核10min,緩沖甘油封片,倒置熒光相差顯微鏡下觀察。 結(jié)果： 體外成功分離培養(yǎng)出人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),經(jīng)免疫熒光鑒定符合血管內(nèi)皮細(xì)胞特征。 結(jié)論： 膠原酶消化培養(yǎng)法可獲得大量人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),從而為下一步的研究提供了種子細(xì)胞。 第2部分降鈣素基因相關(guān)肽人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用 目的： 進(jìn)一步探討降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖的影響和作用。 方法： AlarmarBlue法檢測各組HUVECs增殖 將實(shí)驗(yàn)組劃分為6組,分別是空白對照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。利用AlarmarBlue法檢測各組人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖變化情況。每組設(shè)3個復(fù)孔,各組分別進(jìn)行預(yù)處理,24h后每孔加入10μL AlamarBlue,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱靜置4h后,用多功能酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長530nm和發(fā)射波長590nm處測定熒光值,整個操作過程要避光進(jìn)行。 結(jié)果： 與空白對照組相比,CGRP組能夠明顯促進(jìn)HUVECs的增殖,而在經(jīng)過CGRP拮抗劑CGRP8-37、ERK1/2拮抗劑PD98059、p-38拮抗劑SB203580、JNK拮抗齊SP600125預(yù)干預(yù)后的各實(shí)驗(yàn)組中,CGRP誘導(dǎo)的HUVECs增殖效應(yīng)可受到明顯的抑制。 結(jié)論： CGRP能夠促進(jìn)HUVECs的增殖,并且此效應(yīng)可被ERK1/2、p-38、JNK拮抗劑所抑制,提示MAPK通路在此過程中起作用,CGRP的生物學(xué)機(jī)制可能通過MAPK通路發(fā)揮作用。 第3部分降鈣素基因相關(guān)肽促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)機(jī)制初步探討 目的： 初步探討降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin-gene-related peptide, CGRP)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)促增殖作用的生物學(xué)作用機(jī)制。 方法： 將實(shí)驗(yàn)組劃分為6組,分別是空白對照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。免疫印跡技術(shù)(Western blot)觀察CGRP誘導(dǎo)后ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化表達(dá)變化情況,及CGRP8-37、PD98059、SB203580、SP600125預(yù)處理對ERK1/2、p-38、JNK磷酸化表達(dá)的影響。 結(jié)果： CGRP可在一定范圍內(nèi)呈時間依賴性地誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞ERK1/2、p-38、 JNK的磷酸化,拮抗劑CGRP8-37、PD98059、SB203580和SP600125預(yù)處理后可減弱其磷酸化作用。 結(jié)論： ERK1/2、p38、JNK的磷酸化參與并調(diào)控CGRP促人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖的生物學(xué)作用過程,這提示MAPK通路中ERK1/2、p38和JNK三個途徑均在此過程中起到作用,CGRP可能通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑影響HUVECs的增殖。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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10 陀泳華;降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號：1155818