本文關(guān)鍵詞：富血小板血漿對大鼠脂肪來源干細(xì)胞體外增殖的影響

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【摘要】：目的：探索SD大鼠脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）的分離與體外培養(yǎng)方法，觀察其體外增殖特點(diǎn)、表型特征及定向分化能力。方法：從體質(zhì)量約為120g的SD大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪墊中分離出脂肪組織，采用Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代ADSCs，貼壁法純化、傳代，測定生長曲線。BD流式細(xì)胞儀檢測第3代ADSCs表面標(biāo)記。取第3代細(xì)胞用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化，用油紅O染色鑒定。取第3代細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化，并用Alizarin Red染色鑒定。結(jié)果：采用Ⅰ型膠原酶消化大鼠脂肪組織、貼壁法分離純化能夠得到純度較高的ADSCs，，形態(tài)呈長梭形或多角形，體外擴(kuò)增迅速，生長曲線呈S形。第3代ADSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD45、CD106呈陰性表達(dá)，CD90呈陽性表達(dá)。第3代ADSCs成脂誘導(dǎo)后，油紅O染色細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯；成骨誘導(dǎo)后，Alizarin Red染色細(xì)胞內(nèi)鈣化結(jié)節(jié)明顯。結(jié)論：經(jīng)SD大鼠腹股溝取材并分離純化可以獲得純度較高的ADSCs，體外生長迅速，傳代后能夠進(jìn)一步純化并穩(wěn)定增殖。ADSCs表達(dá)特定的表面分子且具備多向分化潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。 目的：觀察不同濃度富血小板血漿（PRP）對體外培養(yǎng)SD大鼠脂肪來源干細(xì)胞分裂增殖的影響，探討合適作用濃度及作用機(jī)制，為PRP應(yīng)用于臨床脂肪移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1.采用二次離心法提取PRP，并應(yīng)用其對ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為對照組、未激活PRP組、激活PRP組（設(shè)立五個(gè)濃度梯度即1%PRP、5%PRP、10%PRP、15%PRP、20%PRP）。CCK-8法測定增殖情況，在培養(yǎng)后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，進(jìn)行CCK-8測試，用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測各孔吸光度（A值）。測定結(jié)果顯示PRP較為適宜的作用濃度為5%和10%組。2.DNA含量檢測及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白檢測，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組和實(shí)驗(yàn)組（10%PRP）。應(yīng)用PI法，在培養(yǎng)后48小時(shí)，使用流式細(xì)胞儀檢測ADSCs各組DNA含量變化；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測定ADSCs各組細(xì)胞周期素D1（cyclinD1）、p27Kip1的蛋白水平。結(jié)果：PRP處理前后，ADSCs形態(tài)沒有明顯改變。相差顯微鏡下見PRP組細(xì)胞增殖旺盛，胞漿豐富。激活后的各濃度PRP均能夠提高ADSCs的增殖能力，PRP對ADSCs增殖的影響存在明顯時(shí)間依賴性，在適宜濃度范圍內(nèi)，劑量依賴性明顯，劑量過高則呈現(xiàn)抑制作用。DNA含量檢測顯示，經(jīng)過10%濃度PRP處理ADSCs48h后，處于S期和G2/M期的細(xì)胞所占比例呈明顯上升趨勢，同時(shí)，處于G0/G1期的細(xì)胞所占比例呈明顯下降趨勢，即PRP能夠促進(jìn)ADSCs的細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期。 Western blot顯示，10%濃度PRP處理明顯提高了ADSCs的cyclinD1和p27Kip1蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：PRP能夠促進(jìn)大鼠ADSCs體外增殖，PRP通過改變DNA含量和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平促進(jìn)ADSCs體外增殖。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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本文編號：1154107