本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌溶血素Ply蛋白疫苗及BLP技術(shù)應(yīng)用的研究

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【摘要】：肺炎鏈球菌是種常見的致病菌。它是社區(qū)獲得性肺炎最主要的致病原，同時還能夠引起鼻竇炎、中耳炎和腦膜炎等。并且在HIV感染者中，肺炎鏈球菌還能夠引起菌血癥等疾病。在眾多發(fā)展中國家中，肺炎鏈球菌所引起的肺炎是老人與兒童最主要的殺手之；而在發(fā)達國家中，由肺炎鏈球菌導(dǎo)致的中耳炎也是兒科中最常見的疾病之。目前，臨床上被廣泛使用是肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗。這種疫苗通過將肺炎鏈球菌的莢膜多糖結(jié)合在載體蛋白上以提高免疫原性。但是結(jié)合苗疫苗到血清型的限制，，且由于工藝復(fù)雜成本高昂，在發(fā)展中國家無法大規(guī)模推廣。肺炎鏈球菌蛋白疫苗則由于具有血清型不依賴、相對廉價、免疫原性好等特點，而成為了目前肺炎鏈球菌疫苗研發(fā)的熱點。 肺炎鏈球菌溶血素蛋白（Ply）是肺炎鏈球菌主要的毒力因子之，在肺炎鏈球菌侵襲和定植的過程中發(fā)揮著重要的作用。同時在已發(fā)現(xiàn)的各株肺炎鏈球菌間具有良好的保守性。正是由于具有這些特性，本論文將Ply蛋白作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗組分之。Ply作為溶血素，其野生型具有很強的細胞毒性，無法直接作為疫苗的免疫原使用。野生型Ply通過其羧基末端的色氨酸富集環(huán)（Trp-richloop）插入到細胞膜上，并寡聚化形成小孔，從而造成細胞膜破碎。色氨酸富集環(huán)在Ply發(fā)揮其溶血活性的過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究對Ply色氨酸富集環(huán)上兩個關(guān)鍵的氨基酸位點進行點突變，設(shè)計了Ply的減毒突變體PlyM2。利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)成功表達了PlyM2及PlyWT，并進行了純化。經(jīng)過變溫圓二色譜與變溫?zé)晒夤庾V檢測，證明了PlyM2相對于其野生型PlyWT，結(jié)構(gòu)無大改變、熱穩(wěn)定性略有降低。通過減毒安全性實驗證明了PlyM2無明顯細胞毒性，減毒成功。對小鼠使用氫氧化鋁佐劑皮下免疫PlyM2，證明了PlyM2具有良好的免疫原性。且在小鼠肺炎鏈球菌血清型14鼻腔攻毒模型中，得到了與市售疫苗相近的保護率。 在傳統(tǒng)的皮下免疫方式之外，本論文還嘗試使用Bacteria-Like Particle(BLP)技術(shù)以進行鼻腔免疫。BLP技術(shù)是指：乳酸乳球菌經(jīng)過熱酸處理后，核酸及絕大部分蛋白質(zhì)均被酸解，僅殘留肽聚糖骨架形成的細菌樣顆粒，將融合了肽聚糖結(jié)合標(biāo)簽的抗原蛋白結(jié)合在這樣的顆粒表面，形成個具有細菌狀態(tài)的免疫原。這樣的免疫原保持有細菌樣的形態(tài)，具有良好的免疫原性，特別適合于需要黏膜免疫的疫苗應(yīng)用。本論文成功構(gòu)建了帶有肽聚糖標(biāo)簽的融合蛋白PlyPA。將PlyPA結(jié)合到BLP上，并通過免疫熒光共聚焦顯微觀察證明了PlyPA成功的結(jié)合在了BLP的表面。用BLP-PlyPA鼻腔免疫小鼠，證明了這種方式相較傳統(tǒng)的氫氧化鋁佐劑皮下免疫方式能夠獲得更高的呼吸道粘膜中IgA產(chǎn)生量。上述實驗證明了PlyM2作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗組分之的可行性，并提供了可行的鼻腔免疫的方式。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

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本文編號：1153743