本文關(guān)鍵詞：人顆粒酶A活性段的表達、純化及其活性鑒定

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【摘要】：目的:克隆和表達人顆粒酶A(Granzyme A,Gzm A)基因的活性片段(active Granzyme A,a Gzm A)并進行活性鑒定。方法:以全長人Gzm A基因為模板,PCR擴增a Gzm A基因片段,限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后插入原核表達載體p ET24a(+),將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot進行分析。重組蛋白用鎳層析柱親和層析進行純化后,利用BLT底物溶液進行活性鑒定。結(jié)果:PCR擴增得到長約700 bp的基因片段。重組質(zhì)粒p ET24a-a Gzm A經(jīng)酶切和測序證實a Gzm A基因序列正確插入載體質(zhì)粒中。SDS-PAGE顯示在26 k D處有一特異性蛋白條帶。Western blot證實該蛋白可與小鼠抗His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。利用鎳柱親和層析法可從包涵體中純化得到純度較高的重組蛋白,且具有較好的酶活性。結(jié)論:成功制備了具有生物學(xué)活性的人顆粒酶A重組蛋白。
【作者單位】： 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.81072459) 教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(No.NCET-12-0179) 上海大學(xué)生創(chuàng)新活動計劃項目(No.KY2012-56S) 國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(No.1310269032)資助項目
【分類號】：R392.11
【正文快照】： 1本文為國家自然科學(xué)基金(No.81072459)、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(No.NCET-12-0179)、上海大學(xué)生創(chuàng)新活動計劃項目(No.KY2012-56S)和國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(No.1310269032)資助項目。顆粒酶A(Granzyme A,Gzm A)是一種存在于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocy

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