本文關鍵詞：日落黃和胭脂紅酶聯(lián)免疫吸附測定法的建立

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【摘要】：化妝品、食品及醫(yī)藥用品中常使用人工合成色素改善其產(chǎn)品的色澤,因為與天然色素相比,它們價格更加低廉、色澤更穩(wěn)定,并且可以多種色素混合調(diào)色。偶氮類合成色素是合成色素中最大的一類,約占60%-70%。日落黃和胭脂紅都是常用的偶氮類合成色素,常用于藥品、化妝品、食品的著色。但由于偶氮類合成色素及其代謝物潛在的多種毒理學作用如致癌性、致突變性、肝腎毒性等越來越多地被研究證明,因此對于偶氮類合成色素作為食品添加劑使用的安全問題越來越多地受到全世界科研工作者的重視。各國食品監(jiān)督管理組織對合成色素的使用種類和使用量都有嚴格的規(guī)定,我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準GB2760-2011》對于日落黃和胭脂紅等合成色素在不同食品中的添加量也有著嚴格的規(guī)定。但食品添加劑非法使用的事件仍然頻頻發(fā)生,一些惡性事件甚至直接威脅到人民的生命安全,讓廣大消費者對食品添加劑望而生畏。因此,我們需要開發(fā)一種實用的方法對合成色素的添加量進行嚴格控制,從而保障人類的健康。 目前常用于日落黃和胭脂紅等偶氮類合成色素的定量測定的方法主要有高效液相色譜法、分光光度法、毛細管電泳法等,高效液相色譜法及毛細管電泳法具有操作簡單、易于自動化、檢測速度快等優(yōu)勢,但也具有檢測成本高、不利于現(xiàn)場檢測等劣勢。分光光度法是應用較早的一種分析方法,它適用范圍廣、儀器設備簡單、分析成本低,但缺點是準確度不高。本實驗致力于開發(fā)一種靈敏、準確、快速、簡便的分析方法對食品中的日落黃和胭脂紅色素進行添加量檢測,為食品中合成色素的質(zhì)量控制提供合理的方法。 免疫分析法的最大特點就是特異性很高,并且應用范圍廣,具有操作簡單、易于現(xiàn)場操作、靈敏度高等優(yōu)勢,非常適合食品添加劑、農(nóng)藥殘留、藥物雜質(zhì)等微量物質(zhì)的檢測,并且已有文獻報道將免疫分析法應用于蘇丹紅、檸檬黃等合成色素的檢測,得到了很高的靈敏度及極低的檢測限。本實驗建立兩種間接競爭酶聯(lián)免疫分析法對日落黃和胭脂紅進行定量測定。 根據(jù)日落黃及胭脂紅自身的結(jié)構(gòu)特征,本實驗設計合成了其結(jié)構(gòu)類似物作為半抗原,以避免互變異構(gòu)現(xiàn)象,并且采取EDC法、混合酸酐法等常用的蛋白偶聯(lián)方法成功合成了免疫原及包被抗原。將免疫原注射到新西蘭大白兔頸背部,心臟采血后得到多克隆抗體,檢測抗體效價、方陣實驗篩選得到合適的抗體,建立了合適的酶聯(lián)免疫分析法,建立的ELISA法具備高精密度、高準確度,并能夠成功用于食品中日落黃和胭脂紅的檢測。其中日落黃測定方法的靈敏度達到0.52ng/mL,標準曲線的方程為y=0.44651-0.21529x,工作范圍是0.01ng/mL-10ng/mL。日落黃抗體與各種結(jié)構(gòu)相似的色素發(fā)生交叉反應的概率與結(jié)構(gòu)相似度相關,但總體交叉反應率都很低,均在1.5%以下。在碳酸飲料、豆干、鹵肉中的檢測限分別為0.12ng/mL、0.04ng/mL、1.11ng/mL,加樣回收率均在93.21%～106.25%之間,變異系數(shù)均小于15.47%。 胭脂紅檢測方法的靈敏度為36.82ng/mL,建立方法的標準曲線方程為y=0.98155-0.15373x,工作范圍是1ng/mL-10000ng/mL。胭脂紅抗體與5種結(jié)構(gòu)相似的色素發(fā)生交叉反應的概率均在0.3%以下,具有很高的特異性。同時對方法的精密度進行了考察,在3天內(nèi)每天重復5次檢測,得到的批內(nèi)變異系數(shù)在1.7%-6.5%之間,批間變異系數(shù)低于17.7%。本實驗還將此方法同HPLC法進行了對比,HPLC法標準曲線的工作濃度為40-300μg/mL,比ELISA法的線性范圍窄,兩種方法的回收率在98.82%-110.27%之間。但以上結(jié)果都是在PBS緩沖液體系中進行的,還需要進一步研究本方法在食品體系中的應用。 通過本實驗的研究,我們成功制備了日落黃和胭脂紅的半抗原及其多克隆抗體,建立了日落黃和胭脂紅定量測定的酶聯(lián)免疫分析法,為開發(fā)商品化的試劑盒奠定了良好的基礎,并為其它合成色素酶聯(lián)免疫法的開發(fā)提供了參考依據(jù)。
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1152159