本文關(guān)鍵詞：乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌生物膜的影響

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【摘要】：研究背景： 生物膜(biofilm)是阿薩希毛孢子菌感染宿主的重要毒力因素之一,其致病性及耐藥機(jī)制日益受到人們的關(guān)注。既往體外研究發(fā)現(xiàn),生物膜狀態(tài)下真菌對(duì)抗真菌藥物伏立康唑的最低抑菌濃度(SMTC)是游離狀態(tài)下(MIC)的16,00倍左右,其耐藥性顯著提高,可導(dǎo)致生物膜相關(guān)真菌感染治療的失�。灰虼藢ふ乙环N新的、有效治療策略是十分緊迫的。乙醇是一種應(yīng)用廣泛的臨床消毒劑,既往對(duì)于其他病原微生物的研究發(fā)現(xiàn),乙醇具有良好的抑制生物膜形成或清除已形成生物膜的作用；但目前尚無關(guān)于乙醇對(duì)阿薩希生物膜影響的研究。 生物膜相關(guān)感染一般比較難以治療,由于其對(duì)常規(guī)抗真菌藥的高耐藥性,導(dǎo)致治療失敗及患者較高的死亡率。以往的研究顯示,乙醇可以有效抑制白念珠菌及金黃色葡萄球菌生物膜的形成,鑒于白念珠菌與阿薩希毛孢子菌均為酵母菌,且在結(jié)構(gòu)和耐藥性上有諸多相似之處；因此,我們推測(cè),乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌生物膜可能具有抑制作用。乙醇是一種廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)的消毒劑,其優(yōu)勢(shì)在于價(jià)廉,易于獲得且無明顯毒副作用。課題以本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存阿薩希毛孢子菌作為研究對(duì)象,研究乙醇對(duì)其生物膜形成各階段的作用。 研究目的： 1.構(gòu)建阿薩希生物膜體外模型； 2.觀察阿薩希毛孢子菌及其生物膜對(duì)乙醇的敏感性； 3.觀察不同濃度乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌生物膜形成不同階段的作用。 研究方法： 1.構(gòu)建阿薩希生物膜體外模型。 使用96孔板法構(gòu)建阿薩希毛孢子菌生物膜。用PMRI-1640將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期阿薩希毛孢子菌調(diào)成106的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液,加入96孔板的不同孔中,37℃孵育1h后,PBS緩沖液沖洗2次,并更換PMRI-1640,37。C繼續(xù)孵育至48h,其中每24h更換一次PBS緩沖液,從而成功構(gòu)建阿薩希毛孢子菌生物膜。 2.檢測(cè)阿薩希毛孢子菌游離細(xì)胞及生物膜對(duì)乙醇的敏感性。 根據(jù)美國(guó)CLSI的M27-A3微量稀釋法對(duì)阿薩希毛孢子菌其游離細(xì)胞進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),基于96孔板的真菌生物膜藥敏檢測(cè)法測(cè)定其生物膜細(xì)胞對(duì)乙醇敏感性,并用XTT法測(cè)定乙醇作用后,阿薩希毛孢子菌生物膜的代謝活性。 3.觀察不同濃度乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌生物膜形成不同階段的作用。 用PMRI-1640將乙醇調(diào)配成各種不同濃度,分別加入形成于96孔板中不同形成階段的阿薩希毛孢子菌生物膜中(包括：阿薩希毛孢子菌生物膜粘附階段(0.5h,1h,1.5h),阿薩希毛孢子菌生物膜形成階段(2h,4h,8h,12h),阿薩希毛孢子菌生物膜成熟階段(48h),通過倒置顯微鏡觀察和XTT法檢測(cè)乙醇對(duì)其的影響。 研究結(jié)果： 1.構(gòu)建阿薩希毛孢子菌生物膜體外模型。 來源于北京軍區(qū)總院皮膚損傷與修復(fù)研究所中心實(shí)驗(yàn)室的T.asahii CBS2479(臨床來源)、T. asahii CBS8904(環(huán)境來源)、臨床分離株(菌株號(hào)：BZP07003,BZP07004, BZP09001, BZP09002)以及北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌研究中心惠贈(zèng)的臨床分離株(菌株號(hào)：06108,06198,6674,6956)均可形成生物膜,且其體外模型均已成功構(gòu)建。 2.乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌游離細(xì)胞及生物膜的敏感性。 經(jīng)XTT比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不同株阿薩希毛孢子菌生物膜的最低抑菌濃度(MIC)值各不相同,游離細(xì)胞MIC值為4-12.5g/m1,MIC50為8g/ml,MIC80為12.5g/ml；生物膜MIC值為25-50g/ml,SMIC50為25%,SMIC80為50%。 2.觀察不同濃度乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌生物膜形成不同階段的作用。 1)生物膜粘附階段(0.5h,1h,1.5h)：本研究發(fā)現(xiàn)2%乙醇作用1小時(shí)可以明顯抑制阿薩希毛孢子菌細(xì)胞的粘附,有效降低粘附率 2)菌相轉(zhuǎn)換：4%乙醇作用8小時(shí)可以明顯抑制阿薩希毛孢子菌的出芽率,低濃度乙醇(0.125%,0.25%,1%)則可以促進(jìn)阿薩希毛孢子菌的出芽。 3)生物膜早期形成階段(2h,4h,8h,12h)：25%乙醇作用8小時(shí)可明顯抑制阿薩希毛孢子菌生物膜的早期形成過程。 4)成熟生物膜階段(48h)：25%乙醇作用24h可明顯去除阿薩希毛孢子菌成熟生物膜生長(zhǎng),50%乙醇作用24h可有效去除已形成的阿薩希毛孢子菌成熟生物膜。 結(jié)論： 1.阿薩希毛孢子菌有形成生物膜的能力,并且利用96孔板法,可在體外構(gòu)建阿薩希毛孢子菌生物膜模型。 2.不同濃度的乙醇可有效抑制阿薩希毛孢子菌生物膜形成的不同階段。 3.乙醇可有效抑制阿薩希毛孢子菌游離細(xì)胞及生物膜,并且未出現(xiàn)耐受性。 4.為阿薩希相關(guān)生物膜感染提供了一種新的治療策略,并對(duì)真菌生物膜相關(guān)感染的治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：阿薩希毛孢子菌 生物膜 乙醇
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R379.9
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 參考文獻(xiàn)14-15
• 第一部分 阿薩希毛孢子菌生物膜的構(gòu)建15-23
• 材料與方法15-19
• 結(jié)果19-21
• 討論21-23
• 參考文獻(xiàn)23
• 第二部分 阿薩希毛孢子菌生物膜對(duì)乙醇的敏感性23-30
• 材料與方法24-28
• 結(jié)果28-29
• 討論29
• 參考文獻(xiàn)29-30
• 第三部分 乙醇對(duì)阿薩希毛孢子菌粘附后生物膜形成階段的影響30-49
• 材料和方法31-36
• 結(jié)果36-44
• 討論44-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述 真菌生物膜影響因素的研究進(jìn)展49-56
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況56-57
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷57-58
• 致謝58-59

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