本文關鍵詞：乙醇對阿薩希毛孢子菌生物膜的影響

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【摘要】：研究背景： 生物膜(biofilm)是阿薩希毛孢子菌感染宿主的重要毒力因素之一,其致病性及耐藥機制日益受到人們的關注。既往體外研究發(fā)現(xiàn),生物膜狀態(tài)下真菌對抗真菌藥物伏立康唑的最低抑菌濃度(SMTC)是游離狀態(tài)下(MIC)的16,00倍左右,其耐藥性顯著提高,可導致生物膜相關真菌感染治療的失��；因此尋找一種新的、有效治療策略是十分緊迫的。乙醇是一種應用廣泛的臨床消毒劑,既往對于其他病原微生物的研究發(fā)現(xiàn),乙醇具有良好的抑制生物膜形成或清除已形成生物膜的作用；但目前尚無關于乙醇對阿薩希生物膜影響的研究。 生物膜相關感染一般比較難以治療,由于其對常規(guī)抗真菌藥的高耐藥性,導致治療失敗及患者較高的死亡率。以往的研究顯示,乙醇可以有效抑制白念珠菌及金黃色葡萄球菌生物膜的形成,鑒于白念珠菌與阿薩希毛孢子菌均為酵母菌,且在結構和耐藥性上有諸多相似之處；因此,我們推測,乙醇對阿薩希毛孢子菌生物膜可能具有抑制作用。乙醇是一種廣泛用于臨床醫(yī)學的消毒劑,其優(yōu)勢在于價廉,易于獲得且無明顯毒副作用。課題以本實驗室現(xiàn)存阿薩希毛孢子菌作為研究對象,研究乙醇對其生物膜形成各階段的作用。 研究目的： 1.構建阿薩希生物膜體外模型； 2.觀察阿薩希毛孢子菌及其生物膜對乙醇的敏感性； 3.觀察不同濃度乙醇對阿薩希毛孢子菌生物膜形成不同階段的作用。 研究方法： 1.構建阿薩希生物膜體外模型。 使用96孔板法構建阿薩希毛孢子菌生物膜。用PMRI-1640將對數(shù)生長期阿薩希毛孢子菌調成106的標準菌懸液,加入96孔板的不同孔中,37℃孵育1h后,PBS緩沖液沖洗2次,并更換PMRI-1640,37。C繼續(xù)孵育至48h,其中每24h更換一次PBS緩沖液,從而成功構建阿薩希毛孢子菌生物膜。 2.檢測阿薩希毛孢子菌游離細胞及生物膜對乙醇的敏感性。 根據(jù)美國CLSI的M27-A3微量稀釋法對阿薩希毛孢子菌其游離細胞進行藥敏實驗,基于96孔板的真菌生物膜藥敏檢測法測定其生物膜細胞對乙醇敏感性,并用XTT法測定乙醇作用后,阿薩希毛孢子菌生物膜的代謝活性。 3.觀察不同濃度乙醇對阿薩希毛孢子菌生物膜形成不同階段的作用。 用PMRI-1640將乙醇調配成各種不同濃度,分別加入形成于96孔板中不同形成階段的阿薩希毛孢子菌生物膜中(包括：阿薩希毛孢子菌生物膜粘附階段(0.5h,1h,1.5h),阿薩希毛孢子菌生物膜形成階段(2h,4h,8h,12h),阿薩希毛孢子菌生物膜成熟階段(48h),通過倒置顯微鏡觀察和XTT法檢測乙醇對其的影響。 研究結果： 1.構建阿薩希毛孢子菌生物膜體外模型。 來源于北京軍區(qū)總院皮膚損傷與修復研究所中心實驗室的T.asahii CBS2479(臨床來源)、T. asahii CBS8904(環(huán)境來源)、臨床分離株(菌株號：BZP07003,BZP07004, BZP09001, BZP09002)以及北京大學第一醫(yī)院真菌研究中心惠贈的臨床分離株(菌株號：06108,06198,6674,6956)均可形成生物膜,且其體外模型均已成功構建。 2.乙醇對阿薩希毛孢子菌游離細胞及生物膜的敏感性。 經(jīng)XTT比色法檢測發(fā)現(xiàn),不同株阿薩希毛孢子菌生物膜的最低抑菌濃度(MIC)值各不相同,游離細胞MIC值為4-12.5g/m1,MIC50為8g/ml,MIC80為12.5g/ml；生物膜MIC值為25-50g/ml,SMIC50為25%,SMIC80為50%。 2.觀察不同濃度乙醇對阿薩希毛孢子菌生物膜形成不同階段的作用。 1)生物膜粘附階段(0.5h,1h,1.5h)：本研究發(fā)現(xiàn)2%乙醇作用1小時可以明顯抑制阿薩希毛孢子菌細胞的粘附,有效降低粘附率 2)菌相轉換：4%乙醇作用8小時可以明顯抑制阿薩希毛孢子菌的出芽率,低濃度乙醇(0.125%,0.25%,1%)則可以促進阿薩希毛孢子菌的出芽。 3)生物膜早期形成階段(2h,4h,8h,12h)：25%乙醇作用8小時可明顯抑制阿薩希毛孢子菌生物膜的早期形成過程。 4)成熟生物膜階段(48h)：25%乙醇作用24h可明顯去除阿薩希毛孢子菌成熟生物膜生長,50%乙醇作用24h可有效去除已形成的阿薩希毛孢子菌成熟生物膜。 結論： 1.阿薩希毛孢子菌有形成生物膜的能力,并且利用96孔板法,可在體外構建阿薩希毛孢子菌生物膜模型。 2.不同濃度的乙醇可有效抑制阿薩希毛孢子菌生物膜形成的不同階段。 3.乙醇可有效抑制阿薩希毛孢子菌游離細胞及生物膜,并且未出現(xiàn)耐受性。 4.為阿薩希相關生物膜感染提供了一種新的治療策略,并對真菌生物膜相關感染的治療提供了新的思路和實驗依據(jù)。
【關鍵詞】：阿薩希毛孢子菌 生物膜 乙醇
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R379.9
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 參考文獻14-15
• 第一部分 阿薩希毛孢子菌生物膜的構建15-23
• 材料與方法15-19
• 結果19-21
• 討論21-23
• 參考文獻23
• 第二部分 阿薩希毛孢子菌生物膜對乙醇的敏感性23-30
• 材料與方法24-28
• 結果28-29
• 討論29
• 參考文獻29-30
• 第三部分 乙醇對阿薩希毛孢子菌粘附后生物膜形成階段的影響30-49
• 材料和方法31-36
• 結果36-44
• 討論44-46
• 參考文獻46-49
• 綜述 真菌生物膜影響因素的研究進展49-56
• 參考文獻54-56
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況56-57
• 個人簡歷57-58
• 致謝58-59

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本文編號：1134224