本文關(guān)鍵詞：缺血后處理啟動(dòng)細(xì)胞周期促進(jìn)受損心肌組織修復(fù)的研究

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【摘要】：目的：缺血后處理(IschemiaPostconditioning,IPO)作為一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，已經(jīng)證明可以有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡，但是否還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，修復(fù)受損的心肌組織尚不清楚。本研究通過建立大鼠缺血后處理模型，觀察細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67、H3P和細(xì)胞周期蛋白cyclins和CDKs的變化，，研究IPO能否通過啟動(dòng)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而補(bǔ)償受損心肌組織。 方法： 1、模型的建立。健康成年雄性8周齡(220±25g)SD大鼠，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Shamoperation,Sham)、缺血再灌注組(Ischemia/Reperfusion,I/R)、缺血后處理組(IschemicPostconditioning,IPO)。分別于術(shù)后1天、3天、7天和14天檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。 2、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。分別記錄術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：左室舒張末期壓(LVEDP)、左室收縮壓(LVSP)、左室等容期上升最大速率(+dp/dtmax)和左室等容期下降最大速率(-dp/dtmax)。 3、心肌組織細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和H3P的檢測(cè)。分別采用免疫組化SABC法和免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Ki67和H3P的表達(dá)情況，并隨機(jī)選取十個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性單位和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。 4、心肌組織細(xì)胞周期cyclins和CDKs的檢測(cè)。 (1)mRNA水平運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期蛋白(cyclinA、B、D、E)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1、2、4、6)的表達(dá)，并進(jìn)行灰度比值分析； (2)蛋白水平運(yùn)用WesternBlot法檢測(cè)術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)水平，并進(jìn)行灰度比值分析； (3)組織水平運(yùn)用免疫組化SABC法和免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)，并隨機(jī)選取十個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性單位和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果： 1、模型的建立。缺血過程中ST段抬高，表明缺血成功；當(dāng)血液恢復(fù)再灌，ST段恢復(fù)至正常。 2、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)IPO、I/R組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯低于Sham組(P0.05)，同時(shí)LVEDP明顯高于Sham組(P0.05)。與I/R組比較，IPO干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)LVSP及±dp/dtmax均升高(P0.05)，而LVEDP有下降趨勢(shì)。 3、心肌細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67和H3P的檢測(cè)結(jié)果。 (1)免疫組化SABC法檢測(cè)Ki67、H3P的表達(dá)結(jié)果：在心肌組織中散在分布，染色呈棕色的為陽(yáng)性細(xì)胞。Sham組陽(yáng)性細(xì)胞極少，IPO組和I/R組陽(yáng)性細(xì)胞在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的增多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較，IPO組陽(yáng)性單位顯著增多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，并且觀察到正在分裂的心肌細(xì)胞。與I/R組比較，IPO組Ki67陽(yáng)性單位在術(shù)后第3天和7天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，而H3P在術(shù)后第3天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 (2)免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)Ki67、H3P的表達(dá)結(jié)果：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)IPO組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與Sham組比較，在術(shù)后第1天、3天和7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；術(shù)后第3天、7天IPO組和I/R組比較也具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，可能與免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)靈敏度高有關(guān)。 4、心肌組織細(xì)胞周期cyclins和CDKs的檢測(cè)結(jié)果。 (1)mRNA水平檢測(cè)cyclinA、B、D、E和CDK1、2、4、6的表達(dá)結(jié)果：cyclinA2和cyclinB：IPO組和I/R組cyclinA2和cyclinB表達(dá)水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Sham組(P0.05)，且分別在術(shù)后3天和7天達(dá)到峰值。cyclinD：與Sham組比較，I/R組cyclinD表達(dá)水平在術(shù)后1天和7天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，而IPO組cyclinD表達(dá)量分別在術(shù)后1天，3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與I/R組比較，IPO組在術(shù)后第3天表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 cyclinE：與Sham組比較，IPO組cyclinE表達(dá)水平分別在術(shù)后1天，3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。組間比較，IPO組和I/R組cyclinE表達(dá)水平分別在術(shù)后3天，7天和14天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。CDK1：與Sham組比較，IPO組和I/R組CDK1表達(dá)水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。組間比較，術(shù)后3天和7天有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 CDK2：與Sham組比較，I/R組CDK2表達(dá)水平在術(shù)后3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，而IPO組CDK2表達(dá)水平分別在術(shù)后1天，3天和7天具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 CDK4和CDK6表達(dá)量各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (2)蛋白水平檢測(cè)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果。cyclinA2和cyclinB在Sham組幾乎沒有表達(dá)。IPO和I/R組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均有顯著增加(P0.05)。IPO與I/R組比較，cyclinA2表達(dá)水平在術(shù)后1天，3天和7天均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。cyclinB結(jié)果與之相同。 (3)組織水平檢測(cè)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果 免疫組化SABC法檢測(cè)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果：Sham組cyclinA2、cyclinB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)很少，IPO組和I/R組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：cyclinA2IPO組陽(yáng)性單位在術(shù)后第1天、3天和7天顯著大于Sham組，且在術(shù)后3天與I/R組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；cyclinBIPO組陽(yáng)性單位在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)顯著大于Sham組，且在術(shù)后第1天、3天和7天與I/R組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)結(jié)果：cyclinA2術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Sham組cyclinA2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于IPO組和I/R組(P0.05)。組間比較，術(shù)后1天，3天和7天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且IPO組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在3天達(dá)到峰值(P0.05)；cyclinB術(shù)后第1天、3天和7天IPO組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著大于Sham組(P0.05)。組間比較，術(shù)后3天和7天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且IPO組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在3天達(dá)到峰值(P0.05)。 結(jié)論： 1、IPO可有效改善心功能。 2、免疫組化SABC法和免疫熒光雙標(biāo)染色法均證明IPO可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖特異性指標(biāo)Ki67和H3P的表達(dá)，并且觀察到正在分裂的心肌細(xì)胞。 3、IPO誘導(dǎo)成年期保持沉默的cyclinA2基因的表達(dá)，進(jìn)而其它c(diǎn)yclins及CDKs的表達(dá)增加。 4、IPO可以啟動(dòng)心肌組織相關(guān)cyclins和CDKs的表達(dá)，可能通過心肌細(xì)胞的增殖補(bǔ)償或修復(fù)受損的心肌組織。
【關(guān)鍵詞】：缺血后處理 心肌組織 細(xì)胞周期 增殖
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 文略縮詞表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-20
• 第一部分 缺血后處理模型的建立20-26
• 引言20
• 1、材料與方法20-23
• 1.1 主要試劑與儀器20-21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法23
• 2、結(jié)果23-24
• 2.1 模型的建立與鑒定23-24
• 2.2 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血流動(dòng)力學(xué)變化24
• 3、討論24-26
• 第二部分 缺血后處理對(duì)心肌組織細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67、H3P的研究26-32
• 引言26
• 1、材料與方法26-29
• 1.1 主要試劑與儀器26-28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法28-29
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法29
• 2、結(jié)果29-30
• 2.1 免疫組化SABC法檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67、H3P的表達(dá)29-30
• 2.2 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)Ki67、H3P的表達(dá)30
• 3、討論30-32
• 第三部分 缺血后處理對(duì)心肌組織細(xì)胞周期cyclins和CDKs的影響32-46
• 引言32
• 1、材料與方法32-42
• 1.1 主要試劑與儀器32-36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法36-42
• 2、結(jié)果42-43
• 2.1 mRNA水平cyclinA、B、D、E和CDK1、2、4、6的表達(dá)42
• 2.2 蛋白水平cyclinA2和cyclinB的表達(dá)42-43
• 2.3 組織水平檢測(cè)cyclinA2和cyclinB的表達(dá)43
• 3、討論43-46
• 小結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 綜述55-67
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 附錄67-76
• 致謝76-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)介77

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1134052