本文關(guān)鍵詞：甘露聚糖結(jié)合凝集素對人中性粒細(xì)胞功能的影響

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【摘要】：天然免疫系統(tǒng)是抵御病原微生物感染的第一道防線,其主要由參與天然免疫的效應(yīng)分子和效應(yīng)細(xì)胞構(gòu)成。常見的效應(yīng)分子有防御素、補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞因子和溶菌酶等；效應(yīng)細(xì)胞有吞噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等。天然免疫的識別機(jī)制是由多種識別分子及效應(yīng)分子組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其可通過模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)如甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)、肽聚糖識別蛋白、Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)等識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)識別相關(guān)的病原微生物而發(fā)揮作用,參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。 MBL為肝臟合成的血漿蛋白,是天然免疫補(bǔ)體系統(tǒng)中啟動凝集素途徑的關(guān)鍵蛋白。MBL是一種分泌型PRR,是C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族的一員。MBL可選擇性識別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu),可通過凝集素途徑以不依賴抗體和Clq的方式激活補(bǔ)體,從而介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用及發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能,并能與吞噬細(xì)胞表面膠凝素受體結(jié)合而直接介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用,還能清除免疫復(fù)合物和凋亡細(xì)胞。正常人血漿中的MBL水平在40-5000μg/L之間,但是作為一種急性期反應(yīng)蛋白,在應(yīng)激(如病原體感染、外科手術(shù)等)時(shí),其血漿濃度可升高2-3倍�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),膠凝素家族的其他成員如肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A和D(surfactant Protein A-. surfactant protein D, SP-A、SP-D)、補(bǔ)體Clq等具有多種免疫調(diào)節(jié)功能,如SP-A能夠抑制DC的成熟和分化；Fraser等發(fā)現(xiàn)MBL能夠抑制脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-a等細(xì)胞因子。而目前國內(nèi)外關(guān)于MBL對中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils, PMN)功能的影響報(bào)道較少,因此有必要深入探討。 本研究中,我們利用人PMN為細(xì)胞模型,初步研究了有無MBL缺陷人血清條件下MBL對PMN功能的影響,及在白色念珠菌刺激下對PMN功能的影響。 第一章人天然MBL的提取與純化 MBL是肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白,是天然免疫系統(tǒng)中一個(gè)關(guān)鍵的可溶性模式識別受體。正常人血漿中MBL含量較低,約10～5000μg/L,平均約為1200μg/L�；诒究剖业拈L期工作基礎(chǔ),已經(jīng)建立了對人天然MBL分離純化的方法。因有文獻(xiàn)報(bào)道熱原及血漿中IgG有可能干擾實(shí)驗(yàn),因此在本研究中,我們通過甘露聚糖-Sepharose4B親和層析體系,分離得到粗提MBL,經(jīng)LC柱和多粘菌素B凝膠柱去除IgG與LPS,最后得到無熱源的人天然MBL蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot檢測純化MBL的純度及存在形式；同時(shí)應(yīng)用配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定MBL的活性。同時(shí)SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示純化得到的MBL主要以高聚體的形式(分子量200KD)存在,雜蛋白IgG得到明顯的去除；同時(shí)鱟試劑檢測表明,經(jīng)過多粘菌素B凝膠柱純化后的MBL中殘余的LPS量符合無熱源要求；并通過配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)所得的MBL仍保持良好的結(jié)合活性,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)開展提供可靠的保證。 第二章存在補(bǔ)體時(shí)MBL對人PMN功能的影響 PMN作為天然免疫中重要的吞噬細(xì)胞,在抗病原微生物感染中起著重要作用。其在炎癥局部促炎因子和趨化因子的作用下,可快速遷移到炎癥部位并通過釋放炎性細(xì)胞因子、活性氧及脫顆粒等發(fā)揮抗感染作用。PMN作為人體數(shù)量最多的吞噬細(xì)胞,在天然免疫防御中發(fā)揮著極其重要的意義；但在免疫調(diào)節(jié)紊亂的情況下,PMN可能加重炎癥反應(yīng)從而使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的損害,因此對PMN功能調(diào)節(jié)的研究顯得尤為重要。由于MBL也是天然免疫系統(tǒng)重要的效應(yīng)分子,因此我們研究MBL對PMN功能的影響。我們采用ELISA和Dot blot法檢測MBL與微生物的結(jié)合；以ELISA檢測MBL對PMN分泌TNF-α和IL-6的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測及熒光顯微鏡觀察MBL對PMN吞噬功能的影響；qPCR分析MBL對PMN表達(dá)IL-1β,TNF-α和CDllb的影響；應(yīng)用NBT法檢測MBL對PMN呼吸爆發(fā)的影響。ELISA和Dot bolt結(jié)果顯示MBL與微生物結(jié)合并呈濃度依賴關(guān)系；存在MBL缺陷人血清時(shí),MBL促進(jìn)PMN對白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)吞噬,且可被Mannan阻斷,但對吞噬大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)無明顯差別；qPCR結(jié)果顯示：與空白組相比,MBL組PMN表達(dá)IL-1β, TNF-α及CDllb的水平增高；同時(shí)ELISA結(jié)果顯MBL組對比空白組TNF-a和IL-6分泌增加；NBT結(jié)果顯示,MBL組呼吸爆發(fā)程度高于對照組。以上結(jié)果提示MBL能促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌,增強(qiáng)PMN吞噬功能。 第三章無補(bǔ)體存在時(shí)MBL對PMN功能的影響 MBL的糖識別域(carbohydrate-recognition domain, CRD)可識別病原微生物表面的糖結(jié)構(gòu),并通過其CLR與吞噬細(xì)胞表面膠凝素受體結(jié)合,以不依賴補(bǔ)體系統(tǒng),而發(fā)揮直接調(diào)理功能和MBL依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。因此我們研究了無補(bǔ)體存在時(shí)MBL對PMN功能的影響。通過ELISA法檢測MBL對PMN分泌TNF-a和IL-6的影響；應(yīng)用qPCR檢測MBL對PMN表達(dá)IL-1β,TNF-α及IL-6及相關(guān)凋亡基因mRNA的影響；采用NBT法檢測MBL對PMN呼吸爆發(fā)的影響；應(yīng)用hoechst檢測MBL對PMN凋亡的影響。ELISA結(jié)果顯示,C.albicans刺激PMN時(shí),低劑量的MBL (2.5μg/ml)可顯著促進(jìn)PMN分泌TNF-α和IL-6,而較高劑量的MBL(20μg/ml)對比低劑量的MBL(2.5μg/ml), TNF-α的分泌受到顯著的抑制,同時(shí)抑制作用可被Mannan所阻斷；qPCR檢測TNF-α和IL-6mRNA的結(jié)果也與ELISA結(jié)果相似；LPS刺激PMN時(shí),ELISA和qPCR結(jié)果顯示高濃度的MBL可抑制TNF-α的分泌；Hoechst檢測結(jié)果顯示高濃度MBL處理后PMN核質(zhì)染色高亮點(diǎn)明顯增多對比空白組；qPCR檢測結(jié)果顯示高濃度的MBL可上調(diào)Caspase-3和Fas的表達(dá)。以上結(jié)果顯示在白色念珠菌存在時(shí),MBL可能具有雙重免疫功能,提示MBL對機(jī)體的炎癥應(yīng)答的調(diào)節(jié)起重要作用。 綜上所述,我們利用純化人天然MBL研究了MBL對PMN功能的影響,結(jié)果提示MBL的作用可能受到效應(yīng)細(xì)胞的狀態(tài)和微環(huán)境的影響而有所不同。在無病原體條件下,MBL的作用以促炎為主；而在C. albicans(?)口LPS刺激下,MBL的作用具有雙重性,低劑量促炎,而高劑量則抑制炎性因子的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL) 中性粒細(xì)胞(PMN) 調(diào)理吞噬 細(xì)胞因子 呼吸爆發(fā) 白色念珠菌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-19
• 第一章 人血漿MBL的提取與純化19-32
• 1.1 材料與方法19-28
• 1.2 結(jié)果28-30
• 1.3 討論30-32
• 第二章 存在MBL缺陷人血清時(shí)MBL對人中性粒細(xì)胞功能的影響32-48
• 2.1 材料和方法32-41
• 2.2 結(jié)果41-46
• 2.3 討論46-48
• 第三章 無補(bǔ)體存在時(shí)MBL對PMN功能的影響48-63
• 3.1 材料和方法48-57
• 3.2 結(jié)果57-60
• 3.3 討論60-63
• 全文總結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 中英文對照縮略詞語表68-71
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王明永;張麗蕓;張雅妮;雷鳴;劉瑩;陳政良;;聯(lián)合應(yīng)用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然MBL蛋白[J];免疫學(xué)雜志;2008年02期

2 雷艷梅;王燕;張麗蕓;盧曉;陳政良;;甘露聚糖結(jié)合凝集素誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞凋亡[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年05期

3 王明永;張雅妮;張麗蕓;盧曉;雷鳴;李瑞芳;陳政良;;MBL與Raji細(xì)胞結(jié)合特性的研究[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年03期

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本文編號：1121004