本文關鍵詞：單純皰疹病毒Ⅱ型感染細胞多肽ICP22對Vero細胞周期作用的研究

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【摘要】：單純皰疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）屬于皰疹病毒科的α亞科，是最常見的人類病原體之一，有HSV-1和HSV-2兩種血清型,兩型核酸序列同源性高達70%,但感染方式與臨床表現卻有較大差異，且HSV-2感染較HSV-1感染更為普遍。HSV-2感染是一個復雜的過程，而且還涉及病毒的免疫逃逸機制，使病毒去除不干凈。但是潛伏在神經節(jié)病毒是可以被激活的，從而成為一個棘手的臨床問題。所以對HSV-2潛伏及復發(fā)機制的研究在為開發(fā)新藥、清除潛在感染的病毒以及研制預防HSV-2感染的疫苗以提高患者的生活質量等具有重要的理論意義。 ICP22是一種HSV IE/α基因編碼且具有多個結構基序的磷酸化蛋白，是一種非常重要的調節(jié)病毒基因表達的作用因子。在HSV感染時執(zhí)行多種功能：（i）ICP22可定位于細胞核區(qū)與其他病毒蛋白協作來屏蔽宿主核功能以提高病毒感染。（ii）ICP22對多種病毒及細胞的啟動子及增強子具有極強的抑制作用，如P53-mdm-2反式轉錄激活功能的抑制作用。（iii）ICP22通過對聚合酶II的影響從而影響病毒晚期基因的激活和表達。同時，研究發(fā)現ICP22能夠影響一些細胞周期蛋白的活性和表達水平，促進細胞進入S期為病毒復制營造環(huán)境。負責CDK2的激活、減少細胞周期蛋白A和B的水平將細胞阻滯到G0/G1期與G2/M期間的S期。因此，ICP22與HSV-2從潛伏狀態(tài)激活復發(fā)后進入復制增殖密切相關。 為此，以HSV-2333病毒全基因組為模板，特異性擴增HSV-2ICP22基因，經HindIII和KpnI雙酶切并用T4連接酶連接ICP22基因與載體pEGFPN1，菌落PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，，最后測序鑒定重組質粒。提取質粒后瞬轉至Vero細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染36h后細胞中綠色熒光的分布情況并分析在Vero細胞中pEGFP-ICP22的表達過程。最后，RT-PCR鑒定ICP22基因的轉錄。轉染Vero細胞后pEGFP-ICP22表達量的最大值出現在24h-48h間。 pEGFP-ICP22瞬轉于Vero細胞后，MTT檢測結果表明表達的融合蛋白對細胞的活性沒有明顯影響。細胞周期流式實驗表明，重組質粒組S周期細胞占比率明顯高于正常對照組、G2/M周期占比率也明顯高于正常對照組，說明HSV-2ICP22促進Vero細胞進入S期，同時細胞可以順利進入G2/M期。熒光定量PCR結果顯示表達的HSV-2ICP22可上調cyclin E的表達水平，但對cyclin A及cyclin B的表達沒有明顯作用，同時WB結果驗證了cyclin E的差異表達。 基于上述結果，表明HSV-2ICP22能通過上調cyclin E的表達激活CDK2促進細胞進入S期，但并沒有減少細胞周期蛋白A和B的水平將細胞阻滯于S期。
【關鍵詞】：單純皰疹病毒2型 感染細胞多肽22 復發(fā)感染 細胞周期
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R373.11
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞表11-13
• 第一章 緒論13-33
• 1.1 單純皰疹病毒Ⅱ型概述13
• 1.2 HSV 的形態(tài)結構與基因表達13-16
• 1.3 HSV-2 的潛伏復發(fā)與感染治療16-18
• 1.4 HSV ICP22 概述18-30
• 1.4.1 ICP22 與 US1.518-20
• 1.4.2 ICP22 屏蔽宿主核功能以提高病毒感染20-21
• 1.4.3 ICP22 與其它病毒蛋白的調控作用21-25
• 1.4.4 ICP22 與細胞周期25-30
• 1.5 本課題的研究意義及主要內容30-33
• 1.5.1 本課題的研究意義30-31
• 1.5.2 本課題的研究內容31-33
• 第二章 單純皰疹病毒Ⅱ型感染細胞多肽 ICP22 真核表達載體的構建33-50
• 2.1 前言33
• 2.2 實驗材料33-35
• 2.2.1 主要儀器33-34
• 2.2.2 菌株和質粒34
• 2.2.3 主要試劑34-35
• 2.3 技術路線35
• 2.4 實驗方法35-42
• 2.4.1 Vero 細胞的培養(yǎng)35-36
• 2.4.2 HSV-2 的培養(yǎng)36
• 2.4.3 HSV-2 基因組提取及 ICP22 序列擴增36-37
• 2.4.4 凝膠電泳鑒定 PCR 產物37-38
• 2.4.5 凝膠回收純化 PCR 產物38
• 2.4.6 重組質粒 pEGFPN1 的提取38-40
• 2.4.7 pEGFPN1 質粒的雙酶切40-41
• 2.4.8 目的基因與質粒載體的連接41
• 2.4.9 感受細胞的制備以及連接產物的轉化41
• 2.4.10 通過菌落 PCR 進行陽性克隆菌落的鑒定41
• 2.4.11 重組質粒的鑒定41-42
• 2.5 結果與討論42-49
• 2.5.1 HSV-2 對 Vero 細胞的病變作用42-43
• 2.5.2 HSV-2 基因組電泳檢測43
• 2.5.3 ICP22 序列的 PCR 擴增43-44
• 2.5.4 菌落 PCR 鑒定陽性克隆44
• 2.5.5 重組質粒 HindIII、KpnI 雙酶切鑒定44-45
• 2.5.6 重組質粒 pEGFP-ICP22 測序鑒定45-49
• 2.6 討論49
• 2.7 小結49-50
• 第三章 單純皰疹病毒Ⅱ型感染細胞多肽 ICP22 在 Vero 細胞中的表達及鑒定50-58
• 3.1 前言50
• 3.2 實驗材料50-51
• 3.2.1 主要儀器50
• 3.2.2 細胞、菌株和質粒50
• 3.2.3 主要試劑50-51
• 3.3 技術路線51
• 3.4 實驗方法51-55
• 3.4.1 質粒提取51-52
• 3.4.2 測定質粒濃度52
• 3.4.3 質粒瞬時轉染 Vero 細胞52-53
• 3.4.4 RT-PCR 鑒定 ICP22 的轉錄53-55
• 3.4.5 pEGFP-ICP22 表達過程的研究55
• 3.5 結果與討論55-57
• 3.5.1 質粒在 Vero 細胞中的表達55
• 3.5.2 RT-PCR 鑒定 ICP22 在 Vero 細胞中的轉錄55-56
• 3.5.3 pEGFP-ICP22 在 Vero 細胞中的表達過程56-57
• 3.6 討論57
• 3.7 小結57-58
• 第四章 單純皰疹病毒Ⅱ型 ICP22 對 Vero 細胞周期的作用58-69
• 4.1 前言58
• 4.2 實驗材料58-59
• 4.2.1 主要儀器58
• 4.2.2 細胞、菌株和質粒58-59
• 4.2.3 主要試劑59
• 4.3 技術路線59
• 4.4 實驗方法59-63
• 4.4.1 MTT 法檢測 Vero 細胞活性59-60
• 4.4.2 流式檢測 ICP22 對 Vero 細胞周期的影響60
• 4.4.3 QPCR 檢測周期蛋白的表達情況60-61
• 4.4.4 Western blot 鑒定周期蛋白 E 的表達61-63
• 4.4.5 統計學分析63
• 4.5 結果與討論63-67
• 4.5.1 ICP22 對 Vero 細胞活性的影響63
• 4.5.2 ICP22 對 Vero 細胞周期的影響63-64
• 4.5.3 周期蛋白 E、A 和 B mRNA 相對定量分析64-67
• 4.5.4 Westen blot 鑒定周期蛋白 E 的表達67
• 4.6 討論67-68
• 4.7 小結68-69
• 結論與展望69-70
• 參考文獻70-74
• 攻讀碩士學位期間取得的研究成果74-75
• 致謝75-76
• 附件76

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 ;The Herpes Simplex Virus Type 1 Multiple Function Protein ICP27[J];Virologica Sinica;2008年06期

本文編號：1113509