本文關(guān)鍵詞：單純皰疹病毒Ⅱ型感染細(xì)胞多肽ICP22對Vero細(xì)胞周期作用的研究

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【摘要】：單純皰疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）屬于皰疹病毒科的α亞科，是最常見的人類病原體之一，有HSV-1和HSV-2兩種血清型,兩型核酸序列同源性高達(dá)70%,但感染方式與臨床表現(xiàn)卻有較大差異，且HSV-2感染較HSV-1感染更為普遍。HSV-2感染是一個(gè)復(fù)雜的過程，而且還涉及病毒的免疫逃逸機(jī)制，使病毒去除不干凈。但是潛伏在神經(jīng)節(jié)病毒是可以被激活的，從而成為一個(gè)棘手的臨床問題。所以對HSV-2潛伏及復(fù)發(fā)機(jī)制的研究在為開發(fā)新藥、清除潛在感染的病毒以及研制預(yù)防HSV-2感染的疫苗以提高患者的生活質(zhì)量等具有重要的理論意義。 ICP22是一種HSV IE/α基因編碼且具有多個(gè)結(jié)構(gòu)基序的磷酸化蛋白，是一種非常重要的調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)的作用因子。在HSV感染時(shí)執(zhí)行多種功能：（i）ICP22可定位于細(xì)胞核區(qū)與其他病毒蛋白協(xié)作來屏蔽宿主核功能以提高病毒感染。（ii）ICP22對多種病毒及細(xì)胞的啟動(dòng)子及增強(qiáng)子具有極強(qiáng)的抑制作用，如P53-mdm-2反式轉(zhuǎn)錄激活功能的抑制作用。（iii）ICP22通過對聚合酶II的影響從而影響病毒晚期基因的激活和表達(dá)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)ICP22能夠影響一些細(xì)胞周期蛋白的活性和表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期為病毒復(fù)制營造環(huán)境。負(fù)責(zé)CDK2的激活、減少細(xì)胞周期蛋白A和B的水平將細(xì)胞阻滯到G0/G1期與G2/M期間的S期。因此，ICP22與HSV-2從潛伏狀態(tài)激活復(fù)發(fā)后進(jìn)入復(fù)制增殖密切相關(guān)。 為此，以HSV-2333病毒全基因組為模板，特異性擴(kuò)增HSV-2ICP22基因，經(jīng)HindIII和KpnI雙酶切并用T4連接酶連接ICP22基因與載體pEGFPN1，菌落PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，，最后測序鑒定重組質(zhì)粒。提取質(zhì)粒后瞬轉(zhuǎn)至Vero細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染36h后細(xì)胞中綠色熒光的分布情況并分析在Vero細(xì)胞中pEGFP-ICP22的表達(dá)過程。最后，RT-PCR鑒定ICP22基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后pEGFP-ICP22表達(dá)量的最大值出現(xiàn)在24h-48h間。 pEGFP-ICP22瞬轉(zhuǎn)于Vero細(xì)胞后，MTT檢測結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白對細(xì)胞的活性沒有明顯影響。細(xì)胞周期流式實(shí)驗(yàn)表明，重組質(zhì)粒組S周期細(xì)胞占比率明顯高于正常對照組、G2/M周期占比率也明顯高于正常對照組，說明HSV-2ICP22促進(jìn)Vero細(xì)胞進(jìn)入S期，同時(shí)細(xì)胞可以順利進(jìn)入G2/M期。熒光定量PCR結(jié)果顯示表達(dá)的HSV-2ICP22可上調(diào)cyclin E的表達(dá)水平，但對cyclin A及cyclin B的表達(dá)沒有明顯作用，同時(shí)WB結(jié)果驗(yàn)證了cyclin E的差異表達(dá)。 基于上述結(jié)果，表明HSV-2ICP22能通過上調(diào)cyclin E的表達(dá)激活CDK2促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，但并沒有減少細(xì)胞周期蛋白A和B的水平將細(xì)胞阻滯于S期。
【關(guān)鍵詞】：單純皰疹病毒2型 感染細(xì)胞多肽22 復(fù)發(fā)感染 細(xì)胞周期
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373.11
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文縮略詞表11-13
• 第一章 緒論13-33
• 1.1 單純皰疹病毒Ⅱ型概述13
• 1.2 HSV 的形態(tài)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)13-16
• 1.3 HSV-2 的潛伏復(fù)發(fā)與感染治療16-18
• 1.4 HSV ICP22 概述18-30
• 1.4.1 ICP22 與 US1.518-20
• 1.4.2 ICP22 屏蔽宿主核功能以提高病毒感染20-21
• 1.4.3 ICP22 與其它病毒蛋白的調(diào)控作用21-25
• 1.4.4 ICP22 與細(xì)胞周期25-30
• 1.5 本課題的研究意義及主要內(nèi)容30-33
• 1.5.1 本課題的研究意義30-31
• 1.5.2 本課題的研究內(nèi)容31-33
• 第二章 單純皰疹病毒Ⅱ型感染細(xì)胞多肽 ICP22 真核表達(dá)載體的構(gòu)建33-50
• 2.1 前言33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料33-35
• 2.2.1 主要儀器33-34
• 2.2.2 菌株和質(zhì)粒34
• 2.2.3 主要試劑34-35
• 2.3 技術(shù)路線35
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法35-42
• 2.4.1 Vero 細(xì)胞的培養(yǎng)35-36
• 2.4.2 HSV-2 的培養(yǎng)36
• 2.4.3 HSV-2 基因組提取及 ICP22 序列擴(kuò)增36-37
• 2.4.4 凝膠電泳鑒定 PCR 產(chǎn)物37-38
• 2.4.5 凝膠回收純化 PCR 產(chǎn)物38
• 2.4.6 重組質(zhì)粒 pEGFPN1 的提取38-40
• 2.4.7 pEGFPN1 質(zhì)粒的雙酶切40-41
• 2.4.8 目的基因與質(zhì)粒載體的連接41
• 2.4.9 感受細(xì)胞的制備以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化41
• 2.4.10 通過菌落 PCR 進(jìn)行陽性克隆菌落的鑒定41
• 2.4.11 重組質(zhì)粒的鑒定41-42
• 2.5 結(jié)果與討論42-49
• 2.5.1 HSV-2 對 Vero 細(xì)胞的病變作用42-43
• 2.5.2 HSV-2 基因組電泳檢測43
• 2.5.3 ICP22 序列的 PCR 擴(kuò)增43-44
• 2.5.4 菌落 PCR 鑒定陽性克隆44
• 2.5.5 重組質(zhì)粒 HindIII、KpnI 雙酶切鑒定44-45
• 2.5.6 重組質(zhì)粒 pEGFP-ICP22 測序鑒定45-49
• 2.6 討論49
• 2.7 小結(jié)49-50
• 第三章 單純皰疹病毒Ⅱ型感染細(xì)胞多肽 ICP22 在 Vero 細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定50-58
• 3.1 前言50
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 3.2.1 主要儀器50
• 3.2.2 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒50
• 3.2.3 主要試劑50-51
• 3.3 技術(shù)路線51
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 3.4.1 質(zhì)粒提取51-52
• 3.4.2 測定質(zhì)粒濃度52
• 3.4.3 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Vero 細(xì)胞52-53
• 3.4.4 RT-PCR 鑒定 ICP22 的轉(zhuǎn)錄53-55
• 3.4.5 pEGFP-ICP22 表達(dá)過程的研究55
• 3.5 結(jié)果與討論55-57
• 3.5.1 質(zhì)粒在 Vero 細(xì)胞中的表達(dá)55
• 3.5.2 RT-PCR 鑒定 ICP22 在 Vero 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄55-56
• 3.5.3 pEGFP-ICP22 在 Vero 細(xì)胞中的表達(dá)過程56-57
• 3.6 討論57
• 3.7 小結(jié)57-58
• 第四章 單純皰疹病毒Ⅱ型 ICP22 對 Vero 細(xì)胞周期的作用58-69
• 4.1 前言58
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 4.2.1 主要儀器58
• 4.2.2 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒58-59
• 4.2.3 主要試劑59
• 4.3 技術(shù)路線59
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法59-63
• 4.4.1 MTT 法檢測 Vero 細(xì)胞活性59-60
• 4.4.2 流式檢測 ICP22 對 Vero 細(xì)胞周期的影響60
• 4.4.3 QPCR 檢測周期蛋白的表達(dá)情況60-61
• 4.4.4 Western blot 鑒定周期蛋白 E 的表達(dá)61-63
• 4.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析63
• 4.5 結(jié)果與討論63-67
• 4.5.1 ICP22 對 Vero 細(xì)胞活性的影響63
• 4.5.2 ICP22 對 Vero 細(xì)胞周期的影響63-64
• 4.5.3 周期蛋白 E、A 和 B mRNA 相對定量分析64-67
• 4.5.4 Westen blot 鑒定周期蛋白 E 的表達(dá)67
• 4.6 討論67-68
• 4.7 小結(jié)68-69
• 結(jié)論與展望69-70
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果74-75
• 致謝75-76
• 附件76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;The Herpes Simplex Virus Type 1 Multiple Function Protein ICP27[J];Virologica Sinica;2008年06期

本文編號(hào)：1113509