發(fā)布時(shí)間：2017-10-29 15:04

  本文關(guān)鍵詞：用FRET技術(shù)研究TRPC1和Akt在細(xì)胞遷移中的相互作用

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【摘要】：研究背景 細(xì)胞遷移(cell migration)是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞遷移需要內(nèi)外因素的配合,外部因素如表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素1等信號(hào)分子；細(xì)胞內(nèi)因素有信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)、細(xì)胞骨架和分子馬達(dá)、參與粘著斑形成的各種分子等。具體過(guò)程為細(xì)胞外信號(hào)分子與細(xì)胞膜表面上的受體結(jié)合,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子,細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子將運(yùn)動(dòng)信息進(jìn)一步傳給細(xì)胞遷移的執(zhí)行單位——細(xì)胞骨架和分子馬達(dá),進(jìn)而完成一系列的遷移活動(dòng)。種類(lèi)繁多的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子會(huì)相互作用,從而影響細(xì)胞骨架和分子馬達(dá)的分布、結(jié)構(gòu)和活性,達(dá)到精細(xì)調(diào)整細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的目的。 瞬時(shí)受體電位通道(TRP channels)是位于細(xì)胞膜上的一類(lèi)重要的非選擇性陽(yáng)離子通道超家族,主要通透鈣離子、鈉離子等。所有的TRP通道蛋白均具有6次跨膜結(jié)構(gòu)域,形成4聚體(tetramers),于5-6段間形成離子通道小孔,通過(guò)細(xì)胞的雙層脂膜供陽(yáng)離子進(jìn)出細(xì)胞。最初人們對(duì)TRP離子通道的認(rèn)識(shí)僅限于感覺(jué)系統(tǒng),因?yàn)樵撏ǖ劳ㄟ^(guò)感受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的各種刺激,參與痛溫覺(jué)、機(jī)械感覺(jué)以及味覺(jué)的發(fā)生和維持細(xì)胞內(nèi)外的離子穩(wěn)態(tài)等眾多生命活動(dòng)。 TRPC分子的C末端以TRP框?yàn)槠瘘c(diǎn),存在一個(gè)保守的25個(gè)氨基酸序列區(qū),它與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的通道門(mén)控位點(diǎn)有關(guān),TRP結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)TRP通道的功能。TRPC亞家族包括TRPC1-7,共7種亞型。TRPC1在腦、心臟、腎臟、肺、骨骼肌、前列腺、皮膚、睪丸和卵巢都檢測(cè)到其高水平表達(dá)。作為最早被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TRP通道,公認(rèn)的TRPC1的功能是參與受體介導(dǎo)的、鈣依賴(lài)的平滑肌及腺體的分泌和收縮功能,參與細(xì)胞膜受體激活磷脂酶C(PLC)后所介導(dǎo)的鈣離子進(jìn)入。TRPC1通道是一種非選擇性陽(yáng)離子通道,主要通透的離子為鈣離子、鈉離子。TRPC1通過(guò)參與多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡、樹(shù)突形成、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移等。 TRPC1可被配體如外源性小分子、化合物、無(wú)機(jī)離子和內(nèi)源性物質(zhì)鈣離子濃度變化、PLC、STIM1等激活,也可被受體例如G蛋白偶聯(lián)受體或受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)介導(dǎo)的PLC信號(hào)通路激活,被認(rèn)為是最可能的鈣庫(kù)操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。很多研究表明TRPC1與磷脂酰肌醇有相互作用,例如在細(xì)胞極性化過(guò)程中,TRP蛋白、PIP2和PIP3受P13Kγ和PLC的調(diào)節(jié),在細(xì)胞膜上這些分子呈現(xiàn)為相互作用。概括來(lái)說(shuō),PLC調(diào)節(jié)胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)主要通過(guò)和TRPC通道形成分子間的脂質(zhì)連接區(qū)而起作用,這種蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物參與TRPC通道在膜上的定位和表面表達(dá)的調(diào)節(jié)。PIP2水解可以影響TRP通道的門(mén)控,這種調(diào)解的機(jī)制可能與TRPC分子的C末端存在磷脂酰肌醇介導(dǎo)的通道門(mén)控位點(diǎn)有關(guān)。PIP2和PIP3可以介導(dǎo)內(nèi)皮縮血管肽-1激活兔冠狀動(dòng)脈肌細(xì)胞上的TRPC1/5/6。 蛋白激酶B(PKB/Akt)參與多個(gè)信號(hào)通路并扮演著信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子的作用,并且調(diào)控其下游多種分子,在細(xì)胞遷移和侵襲、周期調(diào)控、凋亡和增殖、腫瘤血管生成等方面發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是在腫瘤細(xì)胞遷移方面比較重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路,有研究表明用抑制劑Wortmannin抑制P13K后對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞的遷移有明顯影響,主要是影響了磷酸化Akt蛋白的作用。 近期有研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與肌細(xì)胞的更新和再生,當(dāng)TRPC1通道被抑制或者抑制Ca2+內(nèi)流會(huì)減少PI3K/Akt信號(hào)通路的激活,減慢成肌細(xì)胞的遷移并且損害肌細(xì)胞的再生。反之由TRPC1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流會(huì)增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活,增強(qiáng)肌細(xì)胞的再生能力。 PI3K/Akt信號(hào)通路是在腫瘤研究方面一條比較重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞的凋亡和增殖、腫瘤血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲、周期調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。(1)Akt是P13K下游最重要的信號(hào)分子,它是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,約由480多個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。Akt分子的氨基酸由N末端到C端依次是N端的PH結(jié)構(gòu)域、中間有酶活性的催化結(jié)構(gòu)域和C末端的短的羧基端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Akt活化后的質(zhì)膜轉(zhuǎn)位過(guò)程,它含有7條β折疊,反向平行構(gòu)成β片層一個(gè)“疏水區(qū)”。中間有酶活性的催化結(jié)構(gòu)域含有ATP結(jié)合位點(diǎn),具有催化絲氨酸、蘇氨酸殘基的基團(tuán),可發(fā)生磷酸化而被活化,其中308位點(diǎn)的Thr的磷酸化是Akt活化所必需的；C末端是富含脯氨酸的疏水結(jié)構(gòu)域,可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),其中含有Akt完全活化所必需的第2個(gè)磷酸化位點(diǎn),即473位的Ser。(2)在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中,Akt能被多種物質(zhì)如表皮生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞外基質(zhì)成分等激活,Akt通過(guò)磷酸化和去磷酸化方式調(diào)節(jié)其下游100多種底物分子,從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡機(jī)制。Akt的活化包括兩種,P13K依賴(lài)型和P13K非依賴(lài)型兩種。P13K是細(xì)胞內(nèi)的一種磷脂酰肌醇激酶,它可特異性的活化肌醇基團(tuán)環(huán)上的第3位羥基,具有蛋白激酶和類(lèi)脂激酶雙重活性。(3)Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路的中樞。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)均依靠Akt蛋白的磷酸化。Akt的活化需要Akt蛋白多肽鏈上的Thr308和Ser473同時(shí)發(fā)生磷酸化。具體過(guò)程是：當(dāng)細(xì)胞外因子如表皮生長(zhǎng)因子作用于細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶(RTK),受體酪氨酸激酶和配體結(jié)合后激活細(xì)胞膜上的PI3K, PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3,PIP3可與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Akt和PDK2等蛋白結(jié)合,PIP3與Akt的PH區(qū)結(jié)合后使無(wú)活性的Akt等蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上,同時(shí)催化Akt蛋白鏈上Ser124和Thr450磷酸化獲得催化活性。Ser124和Thr450磷酸化后使Akt蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,暴露出Thr308和Ser473位點(diǎn)。同時(shí),轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜的Akt與PDK1等蛋白進(jìn)一步相互靠近,PDKl蛋白催化Akt的Thr308位點(diǎn)磷酸化,PDK2蛋白催化Akt的Ser473位點(diǎn)磷酸化。Thr308和Ser473的活化最后導(dǎo)致Akt完全活化�；罨腁kt引起下游相關(guān)靶蛋白的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致相應(yīng)靶蛋白激活或失活,從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與存活、增殖或凋亡、細(xì)胞遷移、血管生成等多種細(xì)胞活動(dòng)和生物學(xué)效應(yīng)。 綜上所述,TRPC1和Akt可能在細(xì)胞遷移中有交互作用,但是對(duì)于在細(xì)胞遷移過(guò)程中TRPC1和Akt是否有相互作用還不太清楚,本研究利用表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)刺激誘導(dǎo)cos-7細(xì)胞這一研究細(xì)胞遷移的經(jīng)典模型,通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)探討細(xì)胞遷移過(guò)程中TRPC1和Akt的相互作用。 目的 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建將兩個(gè)目的基因TRPC1和Akt分別重組到熒光表達(dá)載體質(zhì)粒pECFP-C1和pEYFP-C1上,得到pECFP-C1-TRPC1和pEYFP-C1-Akt兩個(gè)重組質(zhì)粒；利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、重組質(zhì)粒表達(dá)融合熒光蛋白技術(shù)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)受體蛋白漂白法等,研究EGF刺激誘導(dǎo)cos-7細(xì)胞遷移過(guò)程中,TRPC1和Akt是否有相互作用。 方法 1.利用分子克隆基因重組技術(shù)獲得目的質(zhì)粒 利用分子克隆基因重組技術(shù),將TRPC1、Akt、和YFP的cDNA分別重組到pECFP-C1、pEYFP-C1、pECFP-C1質(zhì)粒上,得到pECFP-C1-TRPC1、 pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三個(gè)重組質(zhì)粒。 2.COS-7細(xì)胞對(duì)EGF的趨化現(xiàn)象 COS-7細(xì)胞對(duì)EGF呈現(xiàn)出一種趨化現(xiàn)象,在EGF一側(cè)細(xì)胞膜形皺褶。提前將蓋玻片一角切去一小塊置于六孔板的培養(yǎng)孔內(nèi),再將COS-7細(xì)胞均勻種植于其上。在六孔板內(nèi)的蓋玻片缺角處加10nM的EGF,使細(xì)胞發(fā)生EGF的點(diǎn)激活。 3. TRPC1蛋白和Akt蛋白在cos-7細(xì)胞中的免疫熒光定位 4.熒光融合蛋白在cos-7細(xì)胞中的表達(dá)及定位 5.EGF激活cos-7細(xì)胞后熒光融合蛋白的轉(zhuǎn)位 6.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)FRET pECFP-C1-TRPC1使目的基因TRPC1和CFP融合表達(dá),而pEYFP-C1-Akt使Akt和YFP融合表達(dá)。檢測(cè)是否TRPC1和Akt發(fā)生了相互作用,就等同于檢測(cè)CFP和YFP是否發(fā)生了FRET。CFP蛋白和YFP蛋白構(gòu)成一個(gè)能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對(duì),當(dāng)兩者相隔1.0-10.0nnm,并且供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有明顯的重疊,同時(shí)供體的發(fā)射光譜和受體的發(fā)射光譜要完全分開(kāi),且在供體的激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)受體無(wú)激發(fā)。當(dāng)以供體的激發(fā)光激發(fā),供體分子由基態(tài)越遷到激發(fā)態(tài)后,由于偶極-偶極相互作用,供體分子激發(fā)態(tài)能量會(huì)以非輻射的形式有效地被傳遞給受體分子。供體和受體之間發(fā)生FRET,將會(huì)使供體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度降低,受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),同時(shí)伴隨供體熒光壽命縮短和受體熒光壽命延長(zhǎng)。發(fā)生FRET條件：(1)供體的熒光量子產(chǎn)率較高；(2)供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜能有效重疊(大于30%)；(3)供體和受體之間的距離要在1.0-10.0nnm之間。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建pECFP-C1-TRPC1、pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三種質(zhì)粒。 2.在EGF激活的COS-7細(xì)胞中,TRPC1和Akt有共定位現(xiàn)象。 3.表達(dá)融合熒光蛋白TRPC1后用EGF激活COS-7細(xì)胞后,可見(jiàn)TRPC1由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜及近膜區(qū)。 4.表達(dá)融合熒光蛋白Akt后用EGF激活COS-7細(xì)胞后,Akt未發(fā)生變化。 5.共表達(dá)融合熒光蛋白后并用EGF激活COS-7細(xì)胞后,TRPC1和Akt由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜及近膜區(qū),并共定位在細(xì)胞移動(dòng)方向的前極。 6.共表達(dá)融合熒光蛋白,TRPC1和Akt未發(fā)生FRET,說(shuō)明它們之間沒(méi)有相互作用。 7.共表達(dá)融合熒光蛋白后并用EGF激活COS-7細(xì)胞后,TRPC1和Akt發(fā)生了FRET,說(shuō)明它們之間有相互作用。 結(jié)論 在EGF激活cos-7細(xì)胞遷移過(guò)程中,TRPC1和Akt發(fā)生了FRET,表明TRPC1和Akt之間有相互作用。
【關(guān)鍵詞】：FRET TRPC1 Akt 細(xì)胞遷移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-22
• 第一章 構(gòu)建真核熒光表達(dá)載體22-41
• 一 材料與方法22-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22
• 2 儀器設(shè)備22-23
• 3 試劑配法23-24
• 4 實(shí)驗(yàn)方法24-36
• 二 結(jié)果36-39
• 三 討論39-41
• 第二章 TRPC1和AKT在細(xì)胞遷移中的FRET研究41-57
• 一 材料與方法41-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 2 實(shí)驗(yàn)儀器43-44
• 3 實(shí)驗(yàn)方法44-49
• 二 結(jié)果49-54
• 1 TRPC1和Akt在cos-7細(xì)胞中的表達(dá)與分布49
• 2 表達(dá)融合熒光蛋白TRPC1在cos-7細(xì)胞中的表達(dá)與分布49-50
• 3 表達(dá)融合熒光蛋白Akt在cos-7細(xì)胞中的表達(dá)與分布50-51
• 4 共表達(dá)融合熒光蛋白TRPC1和Akt在cos-7中的表達(dá)與分布51
• 5 表達(dá)融合熒光蛋白CFP-YFP檢測(cè)FRET51-52
• 6 FRET檢測(cè)TRPC1和Akt在細(xì)胞遷移中的相互作用52-54
• 三 討論54-57
• 全文小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 英文縮略詞表66-67
• 碩士期間發(fā)表論文67-68
• 致謝68-70

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7 張p，

本文編號(hào)：1113456