本文關(guān)鍵詞：建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法檢測腹瀉患者中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌

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【摘要】：研究背景： 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica, Y. enterocolitica),是近20世紀(jì)80年代以來引起國際上廣泛關(guān)注的一種重要的感染性腹瀉致病菌,于1933年在美國紐約州發(fā)現(xiàn)后,曾引起數(shù)次大規(guī)模的胃腸道內(nèi)或和胃腸道外感染爆發(fā)。上個世紀(jì)80年代中期,我國曾發(fā)生2次大爆發(fā),造成500多人感染。 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種全球分布的食源性病原菌,可引起人類多種腸道癥狀,如腹瀉、腸炎、腸系膜淋巴結(jié)炎以及末端回腸炎,以自限性疾病為主；還可通過淋巴系統(tǒng)播散,引起一系列腸道外并發(fā)癥狀,包括反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑、心內(nèi)膜炎,敗血癥等,不僅對人類身體健康產(chǎn)生較大危害,也嚴(yán)重影響了公共衛(wèi)生,給人類以及社會帶來較大的經(jīng)濟(jì)以及醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前國內(nèi)醫(yī)院尚未把小腸結(jié)腸炎耶爾森菌列入常規(guī)的檢測項目中,醫(yī)務(wù)人員普遍缺乏對本菌的認(rèn)識,臨床醫(yī)生在對胃腸道疾病進(jìn)行診斷時也很少考慮小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的感染,人們可能低估了該菌感染的真實情況。 目前普遍用于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測的方法有傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化鑒定、普通PCR法、Real-time PCR法等。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定對污染樣本進(jìn)行檢測時都需要經(jīng)過前期的增菌,然后再進(jìn)行分離培養(yǎng)和十幾項的生化鑒定,而該菌的致病數(shù)量低,培養(yǎng)增殖緩慢,分離成功率低,敏感性不高,耗時耗力,還可能耽誤臨床感染患者抗生素的使用。以PCR法為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)則需要昂貴的實驗設(shè)備,較高的檢測費用、結(jié)果判斷繁瑣,對檢測人員技術(shù)要求較高等,這些特點使其不適用于現(xiàn)場快速檢測和基層單位推廣普及使用。尋找一種新的快速、簡便、廉價的檢測方法成為研究的熱點。 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)是近十年來發(fā)展起來的一種新型的敏感、特異、方便快捷的體外恒溫鏈置換基因擴(kuò)增技術(shù),針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計2對特異性引物,利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下,特異、高效、快速地進(jìn)行擴(kuò)增,1小時內(nèi)擴(kuò)增效率可達(dá)到109-1010拷貝的數(shù)量級,終點產(chǎn)物檢測通過肉眼觀察即可。由于其經(jīng)濟(jì)、快速、實用而逐步應(yīng)用在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域如：病原體及其耐藥性診斷、基因診斷與治療、胚胎性別鑒定、食品衛(wèi)生檢驗和環(huán)境監(jiān)測等�？勺鳛椴≡w所致疾病早期檢測和鑒定的一種簡單而快速的診斷方法,在對條件較差的基層單位,現(xiàn)場,戰(zhàn)時野外環(huán)境,災(zāi)后地區(qū)病原體的現(xiàn)場快速檢測有著廣闊的應(yīng)用前景。 此外,查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有研究中絕大多數(shù)學(xué)者在進(jìn)行LAMP條件優(yōu)化試驗時,習(xí)慣性地對試驗體系的影響因素進(jìn)行逐一單因素優(yōu)化,繁瑣費時,存在較大的盲目性,而且得到的單因素最佳擴(kuò)增效果組合在一起不一定是最佳的反應(yīng)組合。有學(xué)者利用正交設(shè)計進(jìn)行LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化,正交設(shè)計能成倍地減少試驗次數(shù),但是也要注意,正交設(shè)計之所以能成倍減少試驗次數(shù),是以犧牲分析各因素的部分或大部分交互作用為代價的,且正交設(shè)計表設(shè)計較為麻煩。 析因設(shè)計(也稱全因子實驗設(shè)計),即實驗中涉及所有因素及所有水平全面組合形成實驗條件,各實驗條件下至少做2次獨立重復(fù)實驗。析因設(shè)計是對各因素不同水平的全部組合,故具有全面性和均衡性。析因設(shè)計的最大優(yōu)點是所獲得的信息量很多,可以準(zhǔn)確地估計各實驗因素的主效應(yīng)的大小,還可估計因素之間各級交互作用效應(yīng)的大小。自從著名的英國統(tǒng)計學(xué)家Fisher于20世紀(jì)30年代創(chuàng)立析因設(shè)計并首次將其應(yīng)用在農(nóng)業(yè)試驗中,試驗設(shè)計方法至今已經(jīng)得到了充分的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用,在工業(yè)、醫(yī)藥以及科學(xué)實驗等各個方面均有其蹤跡。 研究目的 1.建立糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的LAMP檢測方法,將析因設(shè)計引入LAMP反應(yīng)的條件優(yōu)化試驗中,并對影響LAMP反應(yīng)的主要因素作進(jìn)一步分析； 2.對優(yōu)化后確定的LAMP最佳反應(yīng)體系進(jìn)行特異度和靈敏度等指標(biāo)的測試,并將其應(yīng)用于臨床腹瀉樣本的實際檢測,同時聯(lián)合普通PCR做平行檢測,對所建立的LAMP方法的實際應(yīng)用效果進(jìn)行評價。 研究方法 1.參考文獻(xiàn)設(shè)計的LAMP引物,把影響LAMP反應(yīng)的主要因素FIP/BIP、 MgCl2、dNTPs作為優(yōu)化對象,每個因素設(shè)定4個水平,建立4×4×4三因素析因設(shè)計表,根據(jù)設(shè)計表共進(jìn)行64組處理,每組重復(fù)2次,對128組LAMP終點產(chǎn)物進(jìn)行OD400測定,把測定的數(shù)值錄入SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,使用描述性分析和方差分析結(jié)果以及多重比較來確定最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系,并對影響LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果的因素順序進(jìn)行分析； 2.使用純菌落DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒分別對不同樣本進(jìn)行DNA提取,對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)株和11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌菌株進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,檢測所建立的LAMP反應(yīng)體系的特異度。從小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA、純培養(yǎng)菌落、模擬感染糞便樣本三個方面對所建立的LAMP法進(jìn)行靈敏度檢測。 3.收集廣州市某社區(qū)醫(yī)院和某二甲醫(yī)院的腹瀉病人糞便樣本,并對樣本進(jìn)行前處理和過夜冷增菌處理,提取過夜冷增菌液的DNA,使用普通PCR法和優(yōu)化后的LAMP法對收集回來的臨床腹瀉患者糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行檢測,并對檢測陽性的冷增菌液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定。比較普通PCR法和LAMP法的檢測情況。 研究結(jié)果 1.參照文獻(xiàn)設(shè)計的4條LAMP引物,根據(jù)4×4×4三因素析因設(shè)計表完成了64次試驗并重復(fù)2次,根據(jù)OD400值通過描述性分析、方差分析和各因素的多重比較確定FIP/BIP、MgCl2,dNTPs的最適合組合：FIP/BIP各1.6μM,dNTPs為1.6mM, MgCl2為2.0mM。最終的LAMP最佳反應(yīng)體系,即在25μl反應(yīng)體系中,FIP/BIP各1.6μM, F3/B3各0.2μM,1.6mMdNTPs,2.0mMMgCl2,8U Bst DNA聚合酶,2.5μl10×Thermopol緩沖液和5μl DNA模板。擴(kuò)增程序為：63℃孵育60min,然后80℃孵育10min。經(jīng)實驗證明,該LAMP反應(yīng)體系重復(fù)性好、可靠穩(wěn)定。方差分析結(jié)果顯示,FIP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素存在交互效應(yīng),各因素之間互相影響,不是單獨存在的。本試驗條件下反應(yīng)體系中3個主要因素對LAMP擴(kuò)增效果影響從大到小依次為：FIP/BIP、Mg2+、dNTPs。 2.對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,僅小腸結(jié)腸炎耶爾森菌出現(xiàn)陽性結(jié)果,其余11株非小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均為陰性,表明所建立的LAMP方法特異性好。以小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為試驗菌株,結(jié)果用肉眼以及紫外透視儀兩種方法結(jié)合觀察,靈檢出限顯示,該LAMP法對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因組DNA最低可檢測濃度約為38.05fg/μl;對于細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測極限約為15CFU/ml;直接對糞便樣本中的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進(jìn)行檢測限為150CFU/g。 3.收集廣州市某社區(qū)醫(yī)院和某二甲醫(yī)院的腹瀉病人糞便樣本539例,對539例腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測后,成功檢出13例樣本中含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,普通PCR檢出11例。取13例陽性樣本的冷增菌液進(jìn)行分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),普通PCR檢出的11例陽性樣本均能培養(yǎng)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,LAMP法比PCR多檢出的2例陽性樣本不能培養(yǎng)出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。以普通PCR為“金標(biāo)準(zhǔn)”,LAMP法的靈敏度為100%,特異度為99.62%,Youden指數(shù)為0.99,陽性預(yù)測值0.846,陰性預(yù)測值1.00,且與PCR法顯示了較好的一致性(McNemar檢驗P=0.500; Kappa=0.915,P=0.000)。 結(jié)論 1.析因設(shè)計試驗與方差分析相結(jié)合優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系,比單因素逐一試驗的方法科學(xué)可靠,適用于LAMP反應(yīng)體系的快速優(yōu)化。 2.本研究參考文獻(xiàn)針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌16S rDNA-23S rDNA間區(qū)序列設(shè)計的引物,對LAMP中的FIP/BIP、MgCl2、dNTPs三因素實現(xiàn)了成功優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化的LAMP法特異度強(qiáng),靈敏度高,快速簡便,在恒溫水浴鍋中敷浴1小時便可完成,不需要昂貴精密的儀器和繁瑣的結(jié)果判斷,通過肉眼觀察即可實現(xiàn)對擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。 3.收集回來的腹瀉標(biāo)本進(jìn)行LAMP法檢測的過程包括過夜冷增菌、DNA提取以及LAMP法擴(kuò)增和結(jié)果判定,全部步驟不到1天便可完成,高效、快速。對腹瀉樣本進(jìn)行檢測時,LAMP法與普通PCR法顯示了良好的一致性。所建立的LAMP法適用于腹瀉樣本中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測。 4. FIP/BIP、dNTPs、Mg2+對LAMP擴(kuò)增效果均有影響,三者之間存在交互效應(yīng),使用析因分析確定LAMP最佳反應(yīng)體系,更準(zhǔn)確更合理。各因素對LAMP反應(yīng)的影響效果大小依次為：FIP/BIP、Mg2+、dNTPs。
【關(guān)鍵詞】：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法 析因設(shè)計 腹瀉
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416;R378.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-28
• 第一部分 利用析因設(shè)計優(yōu)化小腸結(jié)腸炎耶爾森菌LAMP反應(yīng)體系28-42
• 一 材料和方法29-34
• 二 結(jié)果34-38
• 三 討論38-42
• 第二部分 LAMP技術(shù)檢測腹瀉患者糞便中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌42-61
• 一 材料和方法42-50
• 二 結(jié)果50-55
• 三 討論55-61
• 全文小結(jié)61-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 附錄71-73
• 碩士期間論文發(fā)表的情況73-74
• 致謝74-76

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本文編號：1110380