本文關(guān)鍵詞：低氧拮抗細胞程序性壞死的作用及其機制研究

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【摘要】：傳統(tǒng)的細胞程序性死亡概念特指細胞凋亡，而細胞壞死則被認為是細胞被動死亡方式。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，與機體遭遇物理、化學(xué)損傷及嚴重感染時細胞發(fā)生被動的壞死不同，一些體外培養(yǎng)的細胞在腫瘤壞死因子α（TNFα）作用下會發(fā)生細胞死亡，但加入Caspase抑制劑阻斷Caspase活性，并不能阻斷反而促進細胞死亡，且死亡細胞呈現(xiàn)壞死的表型。由于這種壞死受到死亡受體介導(dǎo)的信號調(diào)控，具有明確的調(diào)控蛋白，符合程序性細胞死亡的特性，因而被命名為程序性壞死（Necroptosis)，鑒于該死亡過程依賴于RIP激酶的活性調(diào)控，因此程序性壞死也被定義為依賴于RIP1/RIP3的細胞壞死。 程序性壞死與臨床疾病的相關(guān)性引發(fā)關(guān)注，在動物的缺血性腦梗和心梗模型中，已發(fā)現(xiàn)RIP1激酶抑制劑Necrostain-1(Nec-1)可有效減少梗死面積降低細胞的死亡，提示拮抗細胞程序性壞死可用于治療缺血再灌流帶來的實質(zhì)臟器損傷。 適度低氧對健康的促進作用是近年來的研究熱點，通常在低氧的環(huán)境下，細胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)穩(wěn)定性增強，激活下游靶基因如VEGF、BNIP3等轉(zhuǎn)錄，通過激活這些基因的表達，細胞可以抵抗在常氧無法抵抗的外界應(yīng)激和適應(yīng)缺血缺氧的環(huán)境。大量研究顯示在腦梗、心梗等缺血缺氧性疾病中，低氧預(yù)處理可以幫助細胞對抗細胞凋亡的發(fā)生，由于RIP1激酶抑制劑Nec-1同樣可有效降低心梗、腦梗的死亡面積，證實調(diào)控程序性壞死也是有效阻斷細胞缺血缺氧死亡的重要策略。因此，低氧保護是否也涉及拮抗細胞程序性壞死成為我們研究的主要科學(xué)問題。 我們首先在人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞建立了由腫瘤壞死因子α(TNFα)介導(dǎo)的細胞程序性壞死模型，研究結(jié)果證實TNF-α能呈時間、劑量依賴性地誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞死亡，同時廣譜Caspase抑制劑zVAD能顯著增強TNF-α的細胞毒性，而使用RIP1激酶抑制劑Nec-1或敲低RIP3可拮抗細胞死亡的發(fā)生。對TNF-α誘導(dǎo)死亡的細胞進行檢測，未發(fā)現(xiàn)存在凋亡小體、PARP剪切等細胞凋亡的特征，上述結(jié)果表明TNF-α在SH-SY5Y細胞介導(dǎo)了程序性壞死的發(fā)生。 隨后，利用TNFα誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞程序性壞死的模型，我們觀察了低氧處理對細胞程序性壞死的影響。我們分別采用10%O2和3%O2對細胞進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3%O2能更有效的保護細胞對抗TNF-α介導(dǎo)的程序性壞死，以此為模型進行了后續(xù)有關(guān)低氧拮抗程序性壞死的作用機制研究。 在前期有關(guān)低氧保護細胞免于凋亡的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，低氧介導(dǎo)的HIF-1α信號活化可以激活靶基因BNIP3，進而通過啟動線粒體自噬在低氧中對細胞起保護作用。為探究HIF-1α信號活化是否同樣涉及拮抗細胞程序性壞死的發(fā)生，我們采用RNA干涉技術(shù)敲低SH-SY5Y細胞中的HIF-1α基因，結(jié)果顯示敲低HIF-1α可明顯抑制低氧誘導(dǎo)的BNIP3的表達，但不管是敲低HIF-1α或者敲低BNIP3的表達，都并不影響低氧對SH-SY5Y細胞的保護作用。這些結(jié)果證實低氧拮抗TNFα誘導(dǎo)的細胞程序性壞死并不依賴于HIF-1信號。 TNFα介導(dǎo)的NF-κB信號通路活化在細胞凋亡及壞死過程中都起著重要的負反饋作用，我們發(fā)現(xiàn)雖然抑制NFκB信號通路活化可以顯著增強TNFα介導(dǎo)的細胞壞死，但低氧對細胞壞死的拮抗作用并不依賴于激活NF-κB信號。我們在低氧處理后的細胞信號通路中檢測中發(fā)現(xiàn)低氧可抑制TNF-α對JNK信號的活化，并能拮抗細胞壞死。而pan-caspase抑制劑zVAD-fmk與TNF-α聯(lián)用可以通過增強JNK信號活化破壞低氧的保護作用，使用JNK激酶抑制劑SP600125可以完全恢復(fù)低氧的保護效果，提示低氧的保護作用依賴于對JNK激活的抑制。 我們在實驗中還觀察到采用雷帕霉素或者PI3K激酶抑制劑LY294002啟動自噬可以在常氧狀態(tài)下拮抗TNFα介導(dǎo)的SH-SY5Y細胞程序性壞死，，但兩種試劑對低氧的保護卻并無協(xié)同作用。我們發(fā)現(xiàn)常氧時TNF-α處理后6小時可以誘導(dǎo)細胞自噬，而低氧可促使自噬在TNF-α處理后3h發(fā)生，提示早期啟動自噬有可能參與到低氧的保護機制中。 線粒體是細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的重要器官，而過量產(chǎn)生的ROS與JNK活化及細胞死亡之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)得到大量實驗證實。我們對低氧保護下線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性、線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）、ROS的產(chǎn)生和ATP生成進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧并不能恢復(fù)TNF-α誘導(dǎo)的線粒體去極化，但線粒體復(fù)合體Ⅰ活性受到抑制、ROS的產(chǎn)生減少、ATP的合成減少。即低氧時細胞代謝受到抑制是細胞啟動了自我保護的一種方式，通過主動降低細胞代謝，抑制了ROS的產(chǎn)生，阻斷了JNK激酶的活化及后續(xù)的細胞壞死發(fā)生。 結(jié)論：低氧能通過抑制細胞線粒體能量代謝、啟動細胞自噬、阻斷細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、抑制JNK激酶活化等分子機制抑制TNFα誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞程序性壞死。
【關(guān)鍵詞】：程序性壞死 低氧 ROS JNK 線粒體代謝
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 摘要6-10
• Abstract10-18
• 前言18-22
• 第一部分 TNF-α 誘導(dǎo)的 SH-SY5Y 細胞程序性壞死鑒定22-42
• 1. 實驗材料22-24
• 2. 實驗方法24-30
• 結(jié)果30-39
• 討論39-42
• 第二部分 低氧拮抗 TNF-α 誘導(dǎo)程序性壞死的機制研究42-68
• 1. 材料和方法42-43
• 2. 實驗方法43-47
• 結(jié)果47-64
• 討論64-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-79
• 綜述79-98
• 參考文獻87-98
• 附錄 實驗使用溶液配方98-101
• 個人簡歷101-102
• 致謝102-103

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Inducible nitric oxide synthase contributes to intermittent hypoxia against ischemia/reperfusion injury[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年03期

本文編號：1091382