本文關(guān)鍵詞：戊型肝炎病毒多拷貝分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)

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【摘要】：目的:將胞內(nèi)表達(dá)載體p AO815改建成分泌型表達(dá)載體,并體外構(gòu)建戊型肝炎病毒ORF2128-660多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)一步比較不同轉(zhuǎn)化子在畢赤酵母中的表達(dá)水平,以得到高表達(dá)重組菌株。方法:利用重疊PCR技術(shù)將α-factor信號肽基因與目的基因ORF2128-660拼接后插入去磷酸化的p AO815載體,得到分泌型表達(dá)重組質(zhì)粒α-ORF2128-660/p AO815(單拷貝),然后將Bam HⅠ和BglⅡ雙酶切獲得的目的基因表達(dá)盒(AOX-α-ORF2128-660)插入到去磷酸化的重組質(zhì)粒α-ORF2128-660/p AO815中,得到2(AOX-α-ORF2128-660)/p AO815(2拷貝),電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,甲醇誘導(dǎo),SDS-PAGE分析不同拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的表達(dá)產(chǎn)量,ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物的生物活性。結(jié)果:α-factor信號肽基因與目的基因ORF2128-660已克隆入表達(dá)載體中,目的蛋白分泌至誘導(dǎo)液上清中,相對分子質(zhì)量約為59 000,與陰性對照比,單拷貝、2拷貝轉(zhuǎn)化子表達(dá)的產(chǎn)物均有生物活性但表達(dá)水平無區(qū)別。結(jié)論:成功改建成分泌型表達(dá)載體,構(gòu)建了多拷貝重組表達(dá)質(zhì)粒,并且成功表達(dá)了目的蛋白,為利用改造的p AO815載體表達(dá)其他蛋白奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司 甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心;
【關(guān)鍵詞】： 戊型肝炎病毒 重疊PCR 多拷貝表達(dá)盒 畢赤酵母 p AO載體 胞內(nèi)表達(dá)載體 分泌型表達(dá)載體
【分類號】：R373
【正文快照】： 酵母表達(dá)系統(tǒng)以其表達(dá)產(chǎn)物類似于天然蛋白、能保持很好的生物學(xué)活性、表達(dá)條件易于控制、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢,作為疫苗研制的載體已被成功應(yīng)用[1-2]。由于胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物還需細(xì)胞破碎,才能進(jìn)行SDS-PAGE及下游純化工作等,步驟較繁瑣。外源基因的有效分泌表達(dá),不僅有利于表達(dá)產(chǎn)

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本文編號：1081064