本文關(guān)鍵詞：雷帕霉素及環(huán)孢素對人類調(diào)節(jié)性T細胞增殖影響的實驗研究

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【摘要】：[目的]體外提取培養(yǎng)人類外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg),并驗證其免疫抑制功能；分別觀察雷帕霉素及環(huán)孢素對CD4+CD25+Treg細胞體外增殖的影響,初步探討其可能機制。 [方法]本實驗分為兩部分：第一部分,人類外周血CD4+CD25+Treg細胞的體外提取培養(yǎng)及功能驗證：取新鮮健康成人外周血50-100mL,利用密度梯度離心法得到外周血單核細胞,然后使用人類CD4+CD25+CD127dim/-T細胞分離試劑盒Ⅱ,通過免疫磁珠法進一步提取得到CD4+CD25+Treg細胞,利用流式細胞儀檢測CD4、CD25雙陽性細胞純度,然后取一部分細胞進行羧基熒光素乙酰乙酸染色,連同未經(jīng)染色細胞分別轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)進行培養(yǎng),添加含CD3/CD28單克隆抗體所包被的磁珠及高濃度重組人IL-2等的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,于37.5℃、飽和濕度、5%C02濃度條件下進行培養(yǎng),7天后將染色細胞進行流式細胞儀檢測明確其增殖情況,其余未染色CD4+CD25+Treg細胞繼續(xù)培養(yǎng)7天,定期更換培養(yǎng)基,進行細胞計數(shù)及細胞傳代；將免疫磁珠法陽性選擇中所保留的CD4+CD25-T細胞(效應(yīng)性T細胞)用羧基熒光素乙酰乙酸標記后與同種同體CD4+CD25+Treg細胞1：1混合培養(yǎng)7天,然后經(jīng)流式細胞儀檢測觀察分析CD4+CD25-T細胞的受抑制情況；第二部分,雷帕霉素及環(huán)孢素對人體外周血CD4+CD25+Treg細胞體外增殖的影響：將提取所得CD4+CD25+Treg細胞全部進行羧基熒光素乙酰乙酸標記,然后將細胞分成三組,每組至少設(shè)置3個復(fù)孔進行培養(yǎng),在加入上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,第一組添加濃度為100nmol/L的雷帕霉素試劑,第二組添加濃度為410nmol/L的環(huán)孢素試劑,第三組為空白對照組,不添加任何其他試劑。三組細胞于相同環(huán)境下培養(yǎng),定期更換培養(yǎng)基并添加相應(yīng)試劑,7天后進行流式細胞儀檢測,分析兩種藥物對CD4+CD25+Treg細胞體外增殖的影響。數(shù)據(jù)運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,采用配對樣本t檢驗,檢驗水準α=0.05。 [結(jié)果]第一部分：通過密度梯度離心法結(jié)合免疫磁珠法共提取CD4+CD25+Treg細胞15例,其中1例出現(xiàn)細胞污染,6例雙陽性率低于80%,予以丟棄,其余8例CD4+CD25+Treg細胞純度達到(97±0.8)%,且細胞內(nèi)Foxp3表達率達(99±0.5)%。CD4+CD25+Treg細胞體外正常分化增殖,適宜條件下培養(yǎng)7天后流式細胞儀檢測原代細胞比例占(37.0±3.5)%,14天后光學顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)量可擴增至150倍左右；體外CD4+CD25+Treg細胞與CD4+CD25-T淋巴細胞1：1混合培養(yǎng)7天后,流式細胞儀檢測CD4+CD25-T淋巴細胞原代細胞比例占(79.4±6.9)%,經(jīng)統(tǒng)計學分析CD4+CD25+Treg細胞可明顯抑制CD4+CD25T淋巴細胞的增殖(P0.05)。第二部分：雷帕霉素組中CD4+CD25+Treg細胞培養(yǎng)7天后經(jīng)流式細胞儀檢測原代細胞所占比例為(8.8±3.2)%,空白對照組中原代細胞所占比例為(33.2±4.3)%,通過統(tǒng)計學分析可知雷帕霉素明顯促進了CD4+CD25+Treg細胞的體外增殖(P0.05)；相反的,經(jīng)檢測環(huán)孢素組中,CD4+CD25+Treg細胞培養(yǎng)7天后原代細胞所占比例為(48.9±7.0)%,與空白對照組相比,環(huán)孢素明顯抑制CD4+CD25+Treg細胞的體外增殖(P0.05)。 [結(jié)論]①免疫磁珠法提取得到的CD4+CD25+Treg細胞純度可達到95%以上,Foxp3表達率達99%以上,且具有省時高效、便于操作等眾多優(yōu)點,是進行CD4+CD25+Treg細胞相關(guān)研究的理想提取方式;②雷帕霉素對CD4+CD25+Treg細胞的體外增殖起著明顯促進作用,而環(huán)孢素則抑制CD4+CD25+Treg細胞的增殖分化,可見從CD4+CD25+Treg細胞的角度分析,雷帕霉素一定程度上有利于移植后患者免疫耐受的形成,而環(huán)孢素則不利于其形成。
【關(guān)鍵詞】：CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞 細胞培養(yǎng) 雷帕霉素 環(huán)孢素 免疫耐受
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要.4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-12
• 前言12-16
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、CD4~+CD25~+Treg細胞的體外提取培養(yǎng)及功能驗證16-27
• 1.1 材料和方法16-18
• 1.1.1 標本來源16
• 1.1.2 試劑與材料16
• 1.1.3 相關(guān)儀器16
• 1.1.4 實驗設(shè)計及分組16-17
• 1.1.5 重要試劑配制17-18
• 1.1.6 統(tǒng)計學處理18
• 1.2 結(jié)果18-22
• 1.2.1 CD4~+CD25~+Treg細胞提取純度及Foxp3表達率18-20
• 1.2.2 CD4~+CD25~+Treg細胞體外增殖實驗20-21
• 1.2.3 CD4~+CD25~+Treg細胞的免疫抑制功能實驗21-22
• 1.3 討論22-26
• 1.3.1 CD4~+CD25~+Treg細胞的體外增殖培養(yǎng)22-24
• 1.3.2 CD4~+CD25~+Treg細胞的免疫抑制功能24-26
• 1.4 小結(jié)26-27
• 二、雷帕霉素及環(huán)孢素對CD4~+CD25~+Treg細胞增殖的影響27-35
• 2.1 材料與方法27-28
• 2.1.1 標本來源27
• 2.1.2 試劑與儀器27
• 2.1.3 重要試劑配制27
• 2.1.4 實驗分組及方法27
• 2.1.5 統(tǒng)計學處理27-28
• 2.2 結(jié)果28-30
• 2.2.1 雷帕霉素對CD4~+CD25~+Treg細胞增殖的影響28-29
• 2.2.2 環(huán)孢素對CD4~+CD25~+Treg細胞增殖的影響29-30
• 2.3 討論30-33
• 2.3.1 雷帕霉素促進CD4~+CD25~+Treg細胞體外增殖的機制31-32
• 2.3.2 環(huán)孢素抑制CD4~+CD25~+Treg細胞體外增殖的機制32-33
• 2.3.3 其他免疫抑制劑對CD~4+CD25~+Treg細胞的擴增的影響33
• 2.4 小結(jié)33-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻36-41
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明41-42
• 附錄42-46
• 綜述46-59
• 綜述參考文獻53-59
• 致謝59

【引證文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭成永;梁朝輝;魏可欣;孫國柱;焦保華;趙宗茂;;雷帕霉素對膠質(zhì)瘤患者瘤體解旋酶RECQ1表達的影響研究[J];中國生化藥物雜志;2014年07期

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本文編號：1079198