本文關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因缺陷變異株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究

  更多相關(guān)文章： 鼠傷寒沙門菌 spvB spvC 基因缺陷變異 同源重組 生長(zhǎng)曲線

【摘要】：目的： 構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因缺陷變異株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究。為探討鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB、spvC致病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及利用小鼠模型進(jìn)一步研究該基因的功能提供工具和手段。 方法： 1、用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法，制備鼠傷寒沙門菌spvB/spvC基因缺陷變異株。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB/spvC序列，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR特異性引物，并在各個(gè)引物5’末端加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，，分別擴(kuò)增獲得spvB/spvC基因缺陷性核苷酸片段后，連接至自殺質(zhì)粒pCVD442。將重組的陽(yáng)性自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌SM10λpir內(nèi)，并以接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入含有spvB/spvC基因的鼠傷寒沙門菌野生株中，用蔗糖誘導(dǎo)同源重組。以PCR擴(kuò)增方法觀察重組現(xiàn)象，將完全重組的菌株作為spvB/spvC基因的缺陷變異株，挑選穩(wěn)定傳代的突變株并進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。 2、鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因缺陷變異株及野生株的生物學(xué)特性比較研究。對(duì)兩個(gè)缺失菌株的遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)特性及酸性條件下的生存能力進(jìn)行比較研究。分別將菌株在LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h，每隔1h取樣平板計(jì)數(shù)。將菌株分別在LB瓊脂平板中連續(xù)傳代50代，每隔5代挑取單菌落，PCR擴(kuò)增鑒定，以研究缺失的基因在鼠傷寒沙門菌基因缺陷變異株中的遺傳穩(wěn)定性。用2mL PH4.0的新鮮LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)基因缺失菌株及野生型鼠傷寒沙門菌2h，從第0h起每隔1h取菌液適當(dāng)稀釋后采用平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算生存率。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因缺陷株，經(jīng)PCR及序列分析證實(shí)，spvB變異株中spvB基因的編碼區(qū)有1749個(gè)堿基缺失，spvC基因變異株中spvC基因的編碼區(qū)有711個(gè)堿基缺失，且沒(méi)有發(fā)生極性突變。 2、基因缺陷變異株與野生型相比，無(wú)酸條件下的生長(zhǎng)特性沒(méi)有明顯差別。酸性條件下，spvB、spvC基因缺陷株和野生株的活菌數(shù)都比非酸性條件下的活菌數(shù)明顯降低；且三組菌株在培養(yǎng)第2h時(shí)后的生存率均低于第1h后的生存率，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。spvB、spvC基因缺陷株在酸性環(huán)境中培養(yǎng)1h、2h后接種到LB平板生長(zhǎng)的菌落數(shù)（活菌數(shù)）比野生株明顯減少（P0.01），且生存率均低于野生株（P0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種單基因缺陷株相比在第1h的活菌數(shù)及生存率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；在第2h的spvB基因缺陷株的活菌數(shù)低于spvC基因缺陷株的活菌數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），但生存率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1、運(yùn)用自殺質(zhì)粒成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB/spvC基因缺陷變異株；為進(jìn)一步研究該質(zhì)�；虻墓δ芴峁┝斯ぞ吆褪侄�。 2、基因缺陷變異株與野生型相比，在無(wú)酸條件下的生長(zhǎng)特性沒(méi)有明顯差別；酸性環(huán)境對(duì)沙門菌的生長(zhǎng)有一定的選擇性，且在接觸酸性環(huán)境的2h內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)選擇性逐漸增強(qiáng)；沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB、spvC在鼠傷寒沙門菌克服酸應(yīng)激時(shí)可能發(fā)揮重要作用，但兩基因之間比較對(duì)耐酸的影響無(wú)明顯差異。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門菌 spvB spvC 基因缺陷變異 同源重組 生長(zhǎng)曲線
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 前言11-15
• 第2章 鼠傷寒沙門菌 spvB 基因缺陷變異株的構(gòu)建15-36
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒15-16
• 2.1.2 主要試劑及儀器16
• 2.1.3 主要培養(yǎng)基及試劑配制16-18
• 2.2 方法18-27
• 2.2.1 技術(shù)路線18-19
• 2.2.2 PCR 引物設(shè)計(jì)19
• 2.2.3 spvB 基因缺陷同源性核苷酸片段的克隆19-25
• 2.2.4 重組自殺質(zhì)粒 pCVD-ΔspvB 的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定25-26
• 2.2.5 鼠傷寒沙門氏菌 spvB 基因缺陷變異株的構(gòu)建及鑒定26-27
• 2.3 結(jié)果27-34
• 2.3.1 PCR 擴(kuò)增 spvB 基因上、下游片段27-28
• 2.3.2 重組質(zhì)粒 pMD-ΔspvB 的克隆及鑒定28-29
• 2.3.3 重組自殺質(zhì)粒 pCVD-ΔspvB 的克隆及鑒定29-30
• 2.3.4 鼠傷寒沙門菌 spvB 基因缺陷變異株的制備及鑒定30-31
• 2.3.5 測(cè)序結(jié)果及分析31-34
• 2.4 討論34-36
• 第3章 鼠傷寒沙門菌 spvC 基因缺陷變異株的構(gòu)建36-46
• 3.1 材料36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 技術(shù)路線36
• 3.2.2 PCR 引物設(shè)計(jì)36
• 3.2.3 spvC 基因缺陷同源性核苷酸片段的克隆36-37
• 3.2.4 重組自殺質(zhì)粒 pCVD-ΔspvC 的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定37
• 3.2.5 鼠傷寒沙門氏菌 spvB 基因缺陷變異株的構(gòu)建及鑒定37-38
• 3.3 結(jié)果38-44
• 3.3.1 PCR 擴(kuò)增 spvC 基因上、下游片段38
• 3.3.2 重組質(zhì)粒 pMD-ΔspvC 的克隆及鑒定38-39
• 3.3.3 重組自殺質(zhì)粒 pCVD-ΔspvC 的克隆及鑒定39-40
• 3.3.4 鼠傷寒沙門菌 spvC 基因突變株的制備及鑒定40-41
• 3.3.5 測(cè)序結(jié)果及分析41-44
• 3.4 討論44-46
• 第4章 鼠傷寒沙門菌 spvB、spvC 基因缺陷株生長(zhǎng)特性的測(cè)定46-53
• 4.1 材料46-47
• 4.1.1 菌株46
• 4.1.2 主要試劑及儀器46
• 4.1.3 主要培養(yǎng)基及試劑配制46-47
• 4.2 方法47-48
• 4.2.1 鼠傷寒沙門菌 spvB、spvC 基因缺陷株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定47
• 4.2.2 鼠傷寒沙門菌 spvB、spvC 基因缺陷株的生長(zhǎng)特性鑒定47
• 4.2.3 酸性條件下的生存能力檢測(cè)47-48
• 4.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析48
• 4.3 結(jié)果48-51
• 4.3.1 spvB、spvC 基因缺陷變異株的遺傳穩(wěn)定性48-49
• 4.3.2 spvB、spvC 基因缺陷株及野生株的生長(zhǎng)特性鑒定49-50
• 4.3.3 spvB、spvC 基因缺陷株及野生株酸性條件下的生存能力檢測(cè)50-51
• 4.4 討論51-53
• 第5章 結(jié)論和展望53-54
• 5.1 結(jié)論53
• 5.2 展望53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文60
• 本課題所獲的基金資助60-61
• 綜述61-69
• 參考文獻(xiàn)67-69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳慶法;陳強(qiáng);余曉君;周紅平;柯江維;朱春暉;段榮;;腹瀉兒童沙門菌的耐藥性研究及腸毒素基因與臨床關(guān)系分析[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2011年18期

本文編號(hào)：1073514