本文關(guān)鍵詞：攜帶HIV-1 pol基因的新型SHIV嵌合病毒的構(gòu)建及生物特性分析

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【摘要】：人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus1, HIV-1)和艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)發(fā)現(xiàn)至今已有三十余年,目前仍然嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命�，F(xiàn)階段HIV疫苗研發(fā)尚未成功,臨床上抗病毒治療仍然占據(jù)主導(dǎo)地位；現(xiàn)有抗HIV藥物和治療方案雖然能夠有效抑制感染者及病人體內(nèi)病毒復(fù)制,降低病毒載量,延緩疾病進(jìn)程和延長病人壽命,但是仍然無法完全清除感染者及病人體內(nèi)潛伏病毒。原因在于,HIV作為逆轉(zhuǎn)錄病毒,其逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正活性,在體內(nèi)復(fù)制的過程中產(chǎn)生大量變異,在臨床治療過程中,這些殘余病毒在藥物選擇壓力下產(chǎn)生耐藥突變累積,造成病毒載量反彈,這是艾滋病患者抗病毒治療失敗的主要原因。因此,新藥研發(fā)和組合用藥方案的評估工作勢在必行,體內(nèi)藥物有效性評價在指導(dǎo)臨床用藥方面起著至關(guān)重要的作用。然而目前,臨床上研究分析受到一些不確定因素的影響,如無法長期監(jiān)測病人體內(nèi)病毒變異和耐藥性突變,同時動物模型中缺乏合適的靶標(biāo)病毒,二者共同制約了該領(lǐng)域研究的發(fā)展。針對此現(xiàn)狀,本研究從以下兩個方面展開：第一部分,以艾滋病恒河猴藥物模型為基礎(chǔ),探究體內(nèi)病毒長期變異及耐藥性突變的產(chǎn)生機(jī)制；第二部分,構(gòu)建涵蓋多個艾滋病藥物靶點(diǎn)的嵌合病毒,用于組合藥物篩選研究。 一方面,在本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-SHIV、SIV恒河猴藥物評價模型的基礎(chǔ)上通過監(jiān)測給藥期間與給藥前或者給藥后血漿病毒,發(fā)現(xiàn)RT-SHIV/TC模型G1102V、G1104V、G1105V和G1106V,以及RT-SHIV/AE模型G1109V體內(nèi)病毒對齊多拉米雙夫定敏感性下降,SIVmac239模型RM39、090671、090665和081363對PMPA敏感性下降,提示體內(nèi)耐藥病毒株的出現(xiàn)。為系統(tǒng)監(jiān)測RT基因耐藥位點(diǎn)的變化,本研究建立了一種能從感染猴血漿中擴(kuò)增全長rt基因的PCR方法。使用BioEdit和DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)G1102V在給藥過程中體內(nèi)病毒發(fā)牛17處氨基酸改變,其中M184V為一處已知的抗胞嘧啶類似物藥物拉米夫定(3TC)突變位點(diǎn),1215T為一處T215的回復(fù)突變,該突變本身不會影響病毒對核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的敏感程度,但是提示體內(nèi)可能存在一些像T215Y/F這樣的抗拉米夫定(3TC)突變的存在；G1109V猴體內(nèi)病毒在給藥前就發(fā)生了6處氨基酸突變,雖然沒有發(fā)現(xiàn)已知的抗齊多拉米雙夫定的耐藥突變位點(diǎn),但很可能存在一些潛在的耐藥突變,并在藥物的選擇壓力下累積,從而造成了該猴在給藥過程中血漿病毒載量反彈：SIVmac239感染的4只猴在給藥之后體內(nèi)病毒共有8處氨基酸改變,其中S205L和M502I共同存在于4只猴中,提示可能為抗PMPA潛在的耐藥突變位點(diǎn)。 另一方面,以SIVmac239全長質(zhì)粒為骨架,利用基因工程手段替換進(jìn)HIV-1完整pol基因共得到9株嵌合病毒質(zhì)粒,同時含有HIV-1蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶3個藥物靶點(diǎn),擬用于多種藥物組合用藥評估；轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染上清,發(fā)現(xiàn)8株嵌合病毒均能高水平表達(dá)SIV骨架上的Gag P27蛋白,同時兩株嵌合病毒SHIV-pol-NL43和SHIV-pol-32具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性；分別感染TZM-b1細(xì)胞和CEMx174細(xì)胞鑒定其感染和復(fù)制能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在檢測的時間段內(nèi)感染和復(fù)制能力較弱。通過定點(diǎn)突變技術(shù)將SHIV-pol-32質(zhì)粒上由于構(gòu)建過程中酶切位點(diǎn)的引入而造成的一處氨基酸改變回復(fù)得到SHIV-pol-32-XCApa,感染CEMx174細(xì)胞的第9天可以在細(xì)胞表面檢測到病毒蛋白,說明成功構(gòu)建一株具有感染性SHIV-pol病毒株,進(jìn)一步細(xì)胞和動物水平傳代適應(yīng),以獲得感染和復(fù)制能力較強(qiáng)的嵌合病毒株,本研究為構(gòu)建新型艾滋病藥物模型奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述,本次研究完善了RT-SHIV和SIV/恒河猴藥物評價模型,發(fā)現(xiàn)了一些已知的和潛在的與耐藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)。構(gòu)建得到了一系列的替換進(jìn)HIV-1全長pol基因的SHIV-pol嵌合病毒,本研究為優(yōu)化現(xiàn)有艾滋病藥物模型提供了必要信息,為探索構(gòu)建新型艾滋病藥物模型奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：抗艾滋病藥物 耐藥突變 pol基因 SHIV
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91;R3416
【目錄】：

• 目錄3-4
• 主要英文縮寫詞4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 第一部分14-50
• 一 引言14-15
• 二 實(shí)驗(yàn)材料15-19
• 三 實(shí)驗(yàn)方法19-26
• 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-45
• 五 討論45-50
• 第二部分50-81
• 一 引言50-51
• 二 實(shí)驗(yàn)材料51-54
• 三 實(shí)驗(yàn)方法54-65
• 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-77
• 五 討論77-81
• 結(jié)論81-82
• 參考文獻(xiàn)82-86
• 致謝86-88
• 個人基本情況88-89
• 碩士期間論文發(fā)表及參會情況89-90

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 許琰;馮育芳;王衛(wèi);叢U，

本文編號：1073314