FoxM1核酸探針的構(gòu)建及應(yīng)用
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更多相關(guān)文章: 核酸探針 FoxM1 蛋白 制備 應(yīng)用 檢測
【摘要】:核酸探針,是指能夠與特定的靶分子發(fā)生特異性的相互作用,并被特定方法探知的分子,是一種可以從分子水平上進(jìn)行設(shè)計、合成以及應(yīng)用的新興研究手段,為推動分子生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展起了重要的作用。 本論文以ForkheadBox(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族中的FoxM1為靶標(biāo),建立了一套篩選能夠特異性、高親和力靶定轉(zhuǎn)錄因子FoxM1的核酸適配體(aptamer)的SELEX(指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù))體系,并對篩選得到的核酸適配體與靶物質(zhì)的特異性與親和力進(jìn)行了驗證。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了一種利用分子信標(biāo)(MB)簡單、快速、超微量檢測脫氧核酶酶切產(chǎn)物的方法。 主要工作如下: 1.建立了一套篩選特定蛋白的SELEX技術(shù)方法。運用已構(gòu)建正確的PGEX-4T-1-GST-FoxM1-220-335以及PGEX-4T1-GST質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達(dá)并純化了GST-FoxM1-220-335融合蛋白及其GST蛋白,經(jīng)過八輪體外篩選得到了四條核酸適配體。 2.對篩選得到的核酸適配體對靶物質(zhì)的其特異性與親和力進(jìn)行了驗證。經(jīng)熒光檢測、核酸凝膠阻滯實驗(EMSA)和免疫共沉淀實驗(co-ip)等證實篩選得到的核酸適配體能夠特異性、高親和力的靶定轉(zhuǎn)錄因子FoxM1。 3.基于微球富集技術(shù),利用篩選得到的核酸適配體在體外檢測GST-FoxM1-220-335。 4.在附錄B中,我們建立了一種利用分子信標(biāo)簡單、快速、超微量檢測脫氧核酶酶切產(chǎn)物的方法。分子信標(biāo)(MB)被用來檢測模擬的HCV-RNA酶切產(chǎn)物,檢測下限為0.02nmol/L。
【關(guān)鍵詞】:核酸探針 FoxM1 蛋白 制備 應(yīng)用 檢測
【學(xué)位授予單位】:湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類號】:R3411
【目錄】:
- 摘要5-6
- Abstract6-7
- 英文縮寫7-8
- 目錄8-10
- 第1章 緒論10-16
- 1.1 前言10
- 1.2 SELEX 技術(shù)簡介10-11
- 1.3 核酸適配體(aptamer)簡介11-12
- 1.4 轉(zhuǎn)錄因子 FoxM1 簡介12-13
- 1.5 分子信標(biāo)簡介13-14
- 1.6 本文構(gòu)思14-16
- 1.6.1 研究目的14
- 1.6.2 研究方法及技術(shù)14-16
- 第2章 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的純化16-22
- 2.1 前言16-17
- 2.2 實驗材料17-18
- 2.3 實驗方法18-19
- 2.3.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與小量提取18-19
- 2.3.2 重組質(zhì)粒的酶切與鑒定19
- 2.3.3 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的純化19
- 2.4 實驗結(jié)果19-21
- 2.4.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定19-20
- 2.4.2 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的純化20-21
- 2.5 討論21-22
- 第3章 轉(zhuǎn)錄因子 FoxM1 核酸探針的構(gòu)建22-38
- 3.1 前言22-23
- 3.2 實驗材料23-24
- 3.3 實驗方法24-31
- 3.3.1 SELEX 文庫的構(gòu)建及其引物的設(shè)計24-25
- 3.3.2 轉(zhuǎn)錄因子 FoxM1 核酸適配體的篩選25-27
- 3.3.3 克隆測序及二級結(jié)構(gòu)分析27
- 3.3.4 核酸適配體與 FoxM1 結(jié)合能力分析27-31
- 3.4 實驗結(jié)果31-36
- 3.4.1 轉(zhuǎn)錄因子 FoxM1 核酸適配體的篩選31-33
- 3.4.2 核酸適配體與 FoxM1 結(jié)合能力分析33-36
- 3.5 討論36-38
- 第4章 基于微球富集的核酸適配子體外檢測轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 FoxM138-43
- 4.1 前言38-39
- 4.2 實驗材料39
- 4.3 實驗方法39-41
- 4.3.1 核酸探針的設(shè)計39-40
- 4.3.2 實驗條件優(yōu)化40
- 4.3.3 基于微球富集技術(shù)利用核酸適配子體外檢測轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 FoxM140-41
- 4.4 實驗結(jié)果41-42
- 4.4.1 實驗條件優(yōu)化41-42
- 4.4.2 基于微球富集核酸適配子體外檢測靶蛋白 GST-FoxM1-220-33542
- 4.5 討論42-43
- 結(jié)論43-45
- 參考文獻(xiàn)45-49
- 附錄A 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄49-50
- 附錄B 分子信標(biāo)用于脫氧核酶切割產(chǎn)物的快速檢測50-55
- B.1 前言50
- B.2 實驗材料50-51
- B.3 實驗方法51-52
- B.3.1 人工合成的脫氧核酶酶切產(chǎn)物的檢測51-52
- B.3.2 脫氧核酶模擬的 HCV-RNA 酶切產(chǎn)物的檢測52
- B.4 實驗結(jié)果52-54
- B.4.1 人工合成的脫氧核酶酶切產(chǎn)物的檢測52-53
- B.4.2 脫氧核酶模擬的 HCV-RNA 酶切產(chǎn)物的檢測53-54
- B.5 討論54-55
- 附錄C 常用緩沖液和試劑配方55-58
- 致謝58
【共引文獻(xiàn)】
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,本文編號:1066789
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