本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O成孔過程的原子力顯微鏡研究

  更多相關(guān)文章： 原子力顯微鏡 膽固醇依賴細(xì)胞溶素 產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O 自組裝成孔 高速原子力顯微鏡

【摘要】：蛋白質(zhì)復(fù)合物的正確組裝對(duì)正常行使其功能至關(guān)重要，特別是對(duì)如核糖體和多亞基的孔通道等超大蛋白質(zhì)復(fù)合物而言更是如此。然而由于難以在體外重建整個(gè)過程，我們對(duì)多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物精確自組裝機(jī)理的認(rèn)識(shí)嚴(yán)重缺乏。而成孔毒素（PFTs）從水溶性單體自組裝成同源寡聚體的獨(dú)特特性為我們研究自組裝機(jī)理提供了一個(gè)很好地模型系統(tǒng)。 由多種革蘭氏陽性細(xì)菌分泌的膽固醇依賴溶細(xì)胞素（CDCs）是成孔毒素中的最大的家族，許多膽固醇依賴溶細(xì)胞素具有致病性。本文研究的產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O（PFO）是一種由產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的典型的膽固醇依賴溶細(xì)胞素。產(chǎn)氣莢膜梭菌導(dǎo)致的氣性壞疽可以產(chǎn)生很嚴(yán)重的臨床癥狀。和其他成孔毒素類似，PFO的成孔過程按以下三個(gè)步驟進(jìn)行：首先，PFO水溶性單體以膽固醇作為受體聯(lián)結(jié)到膜上；然后，單體與單體之間相互作用自組裝成未穿孔的孔前體復(fù)合物；最終，，孔前體插入膜中形成孔通道。 PFO能夠形成一系列不同大小的孔復(fù)合物，有的孔復(fù)合物甚至包含超過50個(gè)亞基,直徑超過30nm。自組裝成孔過程的一個(gè)核心問題就是如此多的亞基如何同時(shí)從孔前體轉(zhuǎn)變?yōu)榭讖?fù)合物。例如，假設(shè)一個(gè)由50個(gè)單體構(gòu)成的環(huán)狀復(fù)合物，每個(gè)單體寬為2.5nm，則相互遠(yuǎn)離長達(dá)60nm的兩個(gè)亞基是否可能及如何在同一時(shí)間經(jīng)歷完全相同的轉(zhuǎn)變過程。 我們嘗試分別用常規(guī)AFM，新型溫控Icon AFM系統(tǒng)和高速AFM實(shí)時(shí)觀察PFO的成孔過程。通過常規(guī)AFM的實(shí)時(shí)觀察，我們進(jìn)一步確定弧形復(fù)合物可以在膜上穩(wěn)定存在。通過高速AFM我們觀察到，弧形復(fù)合物可以在膜上形成孔通道，并且當(dāng)復(fù)合物被AFM探針拉拽出來之后，弧形復(fù)合物會(huì)重新聯(lián)結(jié)到膜上的另一個(gè)區(qū)域重新形成孔通道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明弧形復(fù)合物具有良好的成孔功能，從而解決了該領(lǐng)域內(nèi)長期以來對(duì)弧形復(fù)合物成孔功能存在性的爭議。 由于孔復(fù)合物的尺寸分布可以為理解自組裝成孔過程提供有用的信息，我們利用溶液中對(duì)PFO的高分辨AFM成像獲得了前所未有的PFO孔復(fù)合物超高分辨結(jié)構(gòu)信息，并對(duì)PFO孔復(fù)合物所含單體數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。我們意外的發(fā)現(xiàn)，PFO孔復(fù)合物所含的單體數(shù)在6的倍數(shù)處有明顯的峰值，而且發(fā)現(xiàn)最小的孔復(fù)合物是六聚體。因此，我們認(rèn)為組裝/插入過程實(shí)際上更傾向于以六聚體亞復(fù)合物/中間態(tài)的形式進(jìn)行，這種亞復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與較小的亞復(fù)合物不同。結(jié)合前人的研究，我們提出了如下的成孔過程模型：PFO水溶性單體首先通過膽固醇作為受體聯(lián)結(jié)到磷脂膜上，膜上的PFO單體之間相互作用，依次聚集在一起，當(dāng)聚集在一起的單體數(shù)達(dá)到六的時(shí)候，孔前體復(fù)合物能夠獲得足夠的能量發(fā)生構(gòu)象變化，形成一個(gè)以六聚體為峰值的分布的亞復(fù)合物中間態(tài)，隨后構(gòu)象變化后的亞復(fù)合物中間態(tài)插入到細(xì)胞膜內(nèi)形成孔復(fù)合物，同時(shí)停止生長。由于亞復(fù)合物中間態(tài)已經(jīng)是發(fā)生了構(gòu)象變化，因此亞復(fù)合物中間態(tài)只能和中間態(tài)相互作用聚集在一起，而無法和未發(fā)生構(gòu)象變化的寡聚物相互作用�；诖�，在復(fù)合物中如何協(xié)調(diào)如此多亞基行為的難題轉(zhuǎn)化為先協(xié)調(diào)六聚體內(nèi)的構(gòu)象變化再協(xié)調(diào)六聚體之間的構(gòu)象變化來完成。這種嚴(yán)格按等級(jí)劃分的組織結(jié)構(gòu)很可能也適用于其他多成分毒素，也可能更廣泛的適用于大蛋白組裝和生物技術(shù)自組裝成的復(fù)合物。 本研究歸結(jié)起來就是利用AFM高分辨成像和高速實(shí)時(shí)掃描的獨(dú)特優(yōu)勢，從分子水平結(jié)構(gòu)變化來解析PFO在膜上成孔過程中的協(xié)同效應(yīng)，初步揭示了PFO成孔機(jī)理中的兩大問題，第一，證實(shí)了PFO弧形復(fù)合物的成孔功能存在，第二，發(fā)現(xiàn)PFO成孔過程存在一個(gè)六聚體亞復(fù)合物的中間態(tài)，從而提出一個(gè)新的成孔機(jī)理模型。更進(jìn)一步，我們還將通過PFO定點(diǎn)突變體及另兩種相關(guān)蛋白，進(jìn)一步探索這一模型的普適意義。該模型的確立不但為大尺度構(gòu)型變化提供了一個(gè)全新的工作機(jī)制，也為設(shè)計(jì)制備功能性成孔蛋白，尋找干預(yù)靶點(diǎn)等提供了重要基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：原子力顯微鏡 膽固醇依賴細(xì)胞溶素 產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O 自組裝成孔 高速原子力顯微鏡
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 第一章 緒論8-27
• 1.1 原子力顯微鏡（AFM）簡介8-13
• 1.1.1 AFM成像原理和硬件架構(gòu)9-11
• 1.1.2 AFM常規(guī)操作模式11-13
• 1.2 AFM在生物樣品中的研究應(yīng)用13-17
• 1.2.1 AFM對(duì)生物樣品表面的形態(tài)觀測13-14
• 1.2.2 AFM對(duì)生物樣品的納米操縱14-15
• 1.2.3 單分子力譜15-17
• 1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O（PFO）17-20
• 1.3.1 成孔毒素17-18
• 1.3.2 膽固醇依賴溶細(xì)胞素（CDCs）18-19
• 1.3.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素O（PFO）19-20
• 1.4 PFO成孔過程研究進(jìn)展20-24
• 1.4.1 PFO成孔機(jī)理20-22
• 1.4.2 PFO孔復(fù)合物的形態(tài)觀測22-24
• 1.5 本文主要內(nèi)容和意義24-27
• 第二章 AFM研究膜蛋白樣品制備與成像技術(shù)的建立27-40
• 2.1. 概述27-29
• 2.2 AFM對(duì)云母表面進(jìn)行高分辨成像29-31
• 2.3 AFM對(duì)霍亂毒素B五聚體（CTX-B）進(jìn)行高分辨成像31-34
• 2.3.1 霍亂毒素簡介31-32
• 2.3.2 樣品制備32
• 2.3.3 AFM高分辨成像32-34
• 2.4 磷脂雙分子層膜制備34-40
• 2.4.1 磷脂雙分子層簡介34-35
• 2.4.2 磷脂雙分子層膜制備方法35-40
• 第三章 對(duì)PFO樣品的AFM高分辨成像研究40-54
• 3.1 樣品制備40-47
• 3.1.1 囊泡熔融法40-42
• 3.1.2 特制聚四氟乙烯小孔制樣法42-46
• 3.1.3 改進(jìn)的特制聚四氟乙烯小孔制樣法46-47
• 3.2 PFO孔通道AFM高分辨成像47-50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析50-54
• 3.3.1 PFO成孔過程的簡單模型50-52
• 3.3.2 PFO孔通道所含單體數(shù)的統(tǒng)計(jì)分布52-54
• 第四章 實(shí)時(shí)觀察PFO的成孔過程54-64
• 4.1 常規(guī)AFM觀察PFO的成孔過程54-56
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法54
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析54-56
• 4.2 ICON溫控成像56-59
• 4.2.1 ICON溫控系統(tǒng)簡介56-58
• 4.2.2 ICON溫控成像技術(shù)58-59
• 4.3 高速AFM觀察PFO的成孔過程59-64
• 4.3.1 高速AFM簡介59-61
• 4.3.2 高速AFM樣品制備61-63
• 4.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析63-64
• 第五章 結(jié)論與展望64-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72-75

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1063780