本文關鍵詞：產氣莢膜梭菌溶素O成孔過程的原子力顯微鏡研究

  更多相關文章： 原子力顯微鏡 膽固醇依賴細胞溶素 產氣莢膜梭菌溶素O 自組裝成孔 高速原子力顯微鏡

【摘要】：蛋白質復合物的正確組裝對正常行使其功能至關重要，特別是對如核糖體和多亞基的孔通道等超大蛋白質復合物而言更是如此。然而由于難以在體外重建整個過程，我們對多聚體蛋白質復合物精確自組裝機理的認識嚴重缺乏。而成孔毒素（PFTs）從水溶性單體自組裝成同源寡聚體的獨特特性為我們研究自組裝機理提供了一個很好地模型系統(tǒng)。 由多種革蘭氏陽性細菌分泌的膽固醇依賴溶細胞素（CDCs）是成孔毒素中的最大的家族，許多膽固醇依賴溶細胞素具有致病性。本文研究的產氣莢膜梭菌溶素O（PFO）是一種由產氣莢膜梭菌分泌的典型的膽固醇依賴溶細胞素。產氣莢膜梭菌導致的氣性壞疽可以產生很嚴重的臨床癥狀。和其他成孔毒素類似，PFO的成孔過程按以下三個步驟進行：首先，PFO水溶性單體以膽固醇作為受體聯結到膜上；然后，單體與單體之間相互作用自組裝成未穿孔的孔前體復合物；最終，，孔前體插入膜中形成孔通道。 PFO能夠形成一系列不同大小的孔復合物，有的孔復合物甚至包含超過50個亞基,直徑超過30nm。自組裝成孔過程的一個核心問題就是如此多的亞基如何同時從孔前體轉變?yōu)榭讖秃衔铩＠�，假設一個由50個單體構成的環(huán)狀復合物，每個單體寬為2.5nm，則相互遠離長達60nm的兩個亞基是否可能及如何在同一時間經歷完全相同的轉變過程。 我們嘗試分別用常規(guī)AFM，新型溫控Icon AFM系統(tǒng)和高速AFM實時觀察PFO的成孔過程。通過常規(guī)AFM的實時觀察，我們進一步確定弧形復合物可以在膜上穩(wěn)定存在。通過高速AFM我們觀察到，弧形復合物可以在膜上形成孔通道，并且當復合物被AFM探針拉拽出來之后，弧形復合物會重新聯結到膜上的另一個區(qū)域重新形成孔通道。實驗結果表明弧形復合物具有良好的成孔功能，從而解決了該領域內長期以來對弧形復合物成孔功能存在性的爭議。 由于孔復合物的尺寸分布可以為理解自組裝成孔過程提供有用的信息，我們利用溶液中對PFO的高分辨AFM成像獲得了前所未有的PFO孔復合物超高分辨結構信息，并對PFO孔復合物所含單體數進行了統(tǒng)計。我們意外的發(fā)現，PFO孔復合物所含的單體數在6的倍數處有明顯的峰值，而且發(fā)現最小的孔復合物是六聚體。因此，我們認為組裝/插入過程實際上更傾向于以六聚體亞復合物/中間態(tài)的形式進行，這種亞復合物的結構與較小的亞復合物不同。結合前人的研究，我們提出了如下的成孔過程模型：PFO水溶性單體首先通過膽固醇作為受體聯結到磷脂膜上，膜上的PFO單體之間相互作用，依次聚集在一起，當聚集在一起的單體數達到六的時候，孔前體復合物能夠獲得足夠的能量發(fā)生構象變化，形成一個以六聚體為峰值的分布的亞復合物中間態(tài)，隨后構象變化后的亞復合物中間態(tài)插入到細胞膜內形成孔復合物，同時停止生長。由于亞復合物中間態(tài)已經是發(fā)生了構象變化，因此亞復合物中間態(tài)只能和中間態(tài)相互作用聚集在一起，而無法和未發(fā)生構象變化的寡聚物相互作用�；诖�，在復合物中如何協(xié)調如此多亞基行為的難題轉化為先協(xié)調六聚體內的構象變化再協(xié)調六聚體之間的構象變化來完成。這種嚴格按等級劃分的組織結構很可能也適用于其他多成分毒素，也可能更廣泛的適用于大蛋白組裝和生物技術自組裝成的復合物。 本研究歸結起來就是利用AFM高分辨成像和高速實時掃描的獨特優(yōu)勢，從分子水平結構變化來解析PFO在膜上成孔過程中的協(xié)同效應，初步揭示了PFO成孔機理中的兩大問題，第一，證實了PFO弧形復合物的成孔功能存在，第二，發(fā)現PFO成孔過程存在一個六聚體亞復合物的中間態(tài)，從而提出一個新的成孔機理模型。更進一步，我們還將通過PFO定點突變體及另兩種相關蛋白，進一步探索這一模型的普適意義。該模型的確立不但為大尺度構型變化提供了一個全新的工作機制，也為設計制備功能性成孔蛋白，尋找干預靶點等提供了重要基礎。
【關鍵詞】：原子力顯微鏡 膽固醇依賴細胞溶素 產氣莢膜梭菌溶素O 自組裝成孔 高速原子力顯微鏡
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 第一章 緒論8-27
• 1.1 原子力顯微鏡（AFM）簡介8-13
• 1.1.1 AFM成像原理和硬件架構9-11
• 1.1.2 AFM常規(guī)操作模式11-13
• 1.2 AFM在生物樣品中的研究應用13-17
• 1.2.1 AFM對生物樣品表面的形態(tài)觀測13-14
• 1.2.2 AFM對生物樣品的納米操縱14-15
• 1.2.3 單分子力譜15-17
• 1.3 產氣莢膜梭菌溶素O（PFO）17-20
• 1.3.1 成孔毒素17-18
• 1.3.2 膽固醇依賴溶細胞素（CDCs）18-19
• 1.3.3 產氣莢膜梭菌溶素O（PFO）19-20
• 1.4 PFO成孔過程研究進展20-24
• 1.4.1 PFO成孔機理20-22
• 1.4.2 PFO孔復合物的形態(tài)觀測22-24
• 1.5 本文主要內容和意義24-27
• 第二章 AFM研究膜蛋白樣品制備與成像技術的建立27-40
• 2.1. 概述27-29
• 2.2 AFM對云母表面進行高分辨成像29-31
• 2.3 AFM對霍亂毒素B五聚體（CTX-B）進行高分辨成像31-34
• 2.3.1 霍亂毒素簡介31-32
• 2.3.2 樣品制備32
• 2.3.3 AFM高分辨成像32-34
• 2.4 磷脂雙分子層膜制備34-40
• 2.4.1 磷脂雙分子層簡介34-35
• 2.4.2 磷脂雙分子層膜制備方法35-40
• 第三章 對PFO樣品的AFM高分辨成像研究40-54
• 3.1 樣品制備40-47
• 3.1.1 囊泡熔融法40-42
• 3.1.2 特制聚四氟乙烯小孔制樣法42-46
• 3.1.3 改進的特制聚四氟乙烯小孔制樣法46-47
• 3.2 PFO孔通道AFM高分辨成像47-50
• 3.3 實驗結果分析50-54
• 3.3.1 PFO成孔過程的簡單模型50-52
• 3.3.2 PFO孔通道所含單體數的統(tǒng)計分布52-54
• 第四章 實時觀察PFO的成孔過程54-64
• 4.1 常規(guī)AFM觀察PFO的成孔過程54-56
• 4.1.1 實驗材料與實驗方法54
• 4.1.2 實驗結果分析54-56
• 4.2 ICON溫控成像56-59
• 4.2.1 ICON溫控系統(tǒng)簡介56-58
• 4.2.2 ICON溫控成像技術58-59
• 4.3 高速AFM觀察PFO的成孔過程59-64
• 4.3.1 高速AFM簡介59-61
• 4.3.2 高速AFM樣品制備61-63
• 4.3.3 實驗結果分析63-64
• 第五章 結論與展望64-67
• 參考文獻67-72
• 致謝72-75

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前5條

1 王芳芳;黃峰;;高速及高分辨率原子力顯微鏡用于研究Trichoderma reesei纖維素酶在結晶纖維素上的行為[J];林產化學與工業(yè);2014年03期

2 陽睿;李英姿;張立文;蔣沙汝;錢建強;;模糊PID控制的原子力顯微鏡仿真平臺[J];實驗室研究與探索;2014年01期

3 張金金;呂軍鴻;孫潔林;胡鈞;CZAJKOWSKY Daniel M;沈軼;;Direct Resolution of the Pitch of DNA on Positively Charged Lipid Bilayers by Frequency-Modulation AFM[J];Journal of Shanghai Jiaotong University(Science);2014年05期

4 羅夢麟;邵志峰;沈軼;CZAJKOWSKY Daniel M;孫潔林;;Novel Experimental Strategy for High Resolution AFM Imaging of Membrane-Associated Bacterial Toxins[J];Journal of Shanghai Jiaotong University(Science);2014年05期

5 熊壯;Bernard Legrand;;微機電系統(tǒng)諧振器原子力顯微鏡探針設計與檢測（英文）[J];強激光與粒子束;2015年02期

中國博士學位論文全文數據庫 前4條

1 程方俊;黃顙魚潰瘍綜合征病原菌及主要毒力因子研究[D];西南大學;2012年

2 彭彥孟;CD86是NK細胞的激活性受體[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

3 呂爽;人參皂苷Rh2衍生物體外促進IFN-γ分泌及CTLL-2細胞增殖的作用研究[D];吉林大學;2014年

4 孫鳳鳴;基于MEMS的陣列式掃描探針顯微鏡測頭理論與技術研究[D];天津大學;2013年

中國碩士學位論文全文數據庫 前6條

1 吳振廣;一種壓電陶瓷管掃描器的設計及其實驗系統(tǒng)研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2012年

2 王國梁;用于生物醫(yī)學的原子力顯微檢測技術研究[D];長春理工大學;2014年

3 王娟;表達EGFP的重組產單核細胞李氏桿菌的構建及其免疫特性研究[D];南京農業(yè)大學;2013年

4 王奇;基于DNA折紙的DNA復制的原子力顯微術研究[D];中國科學院研究生院（上海應用物理研究所）;2014年

5 盛薇薇;適配蛋白LAT在重型再生障礙性貧血T細胞活化過程中作用機制的研究[D];天津醫(yī)科大學;2014年

6 曹延超;淇河鯽穿孔素基因的克隆與表達研究[D];河南師范大學;2014年

本文編號：1063780