本文關(guān)鍵詞：特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：第一章特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用研究 目的： 動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis,AS）是以動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉著，形成粥糜狀病灶及纖維增生使管壁變硬為特征的多因素疾病。其關(guān)鍵在于血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致脂質(zhì)沉積于動(dòng)脈壁內(nèi)皮下層，誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下吞噬脂質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞大量沉積，引發(fā)一系列炎癥和免疫反應(yīng)等復(fù)雜的病理進(jìn)程，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。研究表明NF-κB活化因子1（nuclear factor kappa B activator1，ACT1）主要介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-17信號(hào)通路的活化并參與炎癥反應(yīng)。但是否特異性抑制巨噬細(xì)胞的ACT1表達(dá)會(huì)影響動(dòng)脈粥樣硬斑塊形成，目前尚未見報(bào)道。因此在這一部分我們以ApoE-/-小鼠和ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠為研究對(duì)象，用高脂飼料誘導(dǎo)建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，深入研究特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣斑塊形成的影響。 方法： 將Anti-ACT1小鼠和ApoE-/-小鼠進(jìn)行雜交，獲得穩(wěn)定的ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠，分別取ApoE-/-和ApoE-/-; Anti-ACT1雄性小鼠（8-10周齡）各20只，以高脂飼料誘導(dǎo)8周，收集各組織樣本。油紅O染色觀察兩種小鼠主動(dòng)脈根部斑塊形成以及胸腹主動(dòng)脈斑塊面積；免疫組化分析粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤情況，用免疫熒光分析ACT1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)和定位情況。 結(jié)果： 1.高脂飼料誘導(dǎo)的ApoE-/-;Anti-ACT1及ApoE-/-小鼠體重均隨喂養(yǎng)時(shí)間有明顯增加，但在各時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠的體重?zé)o顯著性差異。 ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠的主動(dòng)脈根部及胸腹主動(dòng)脈斑塊面積明顯小于ApoE-/-小鼠。與ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量有顯著減少。ApoE-/-;Anti-ACT1小鼠血清TC和LDL-C的水平與ApoE-/-小鼠相比明顯降低，HDL-C和TG水平?jīng)]有顯著性差異。 結(jié)論： 特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)后能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并減少主動(dòng)脈根部斑塊中巨噬細(xì)胞的浸潤，同時(shí)顯著降低高脂誘導(dǎo)的小鼠血清TC和LDL-C的水平。ACT1主要在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞上有表達(dá)。 第二章特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響 目的： 第一部分研究結(jié)果顯示特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)后可顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和明顯減少斑塊中巨噬細(xì)胞浸潤，且ACT1蛋白僅在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細(xì)胞上有表達(dá)。由于動(dòng)脈粥樣斑塊與巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞沉積有密切關(guān)系。因此，我們提出是否ACT1參與了泡沫細(xì)胞形成？本部分旨在進(jìn)一步研究特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)后對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響。 方法： 分別提取8-10周齡ApoE-/-和ApoE-/-;Anti-ACT1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，用dil-oxLDL分別處理37℃6h和4℃2h，熒光共聚焦顯微鏡下觀察不同來源巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL結(jié)合和吞噬的情況，另外用oxLDL處理不同來源巨噬細(xì)胞24h后，油紅O染色觀察泡沫細(xì)胞形成的差異。 結(jié)果： 1.與ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在dil-oxLDL處理后細(xì)胞吞噬dil-oxLDL量明顯減少。 2.與ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在oxLDL處理后，泡沫細(xì)胞數(shù)量顯著降低。 結(jié)論： 特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬作用和泡沫細(xì)胞形成。 第三章特異性抑制巨噬細(xì)胞ACT1表達(dá)對(duì)泡沫細(xì)胞形成的作用機(jī)制 目的： 泡沫細(xì)胞的形成目前證實(shí)主要與巨噬細(xì)胞上清道夫受體（CD36和SR-A）以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCA1/ABCG1）的表達(dá)和活化異常有密切關(guān)系，而MAPKs（JNK和p38MAPK）信號(hào)途徑活化被證實(shí)參與調(diào)控泡沫細(xì)胞形成和清道夫受體的表達(dá)。ACT1作為IL-17細(xì)胞因子信號(hào)途徑下游的適配器蛋白主要介導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化和炎癥反應(yīng)，但同時(shí)研究也顯示ACT1還可介導(dǎo)MAPK信號(hào)途徑的活化，因此基于我們前兩部分的研究結(jié)果，在本部分中，我們?cè)隗w外原代和人單核細(xì)胞株上進(jìn)一步探討ACT1調(diào)控泡沫細(xì)胞形成的信號(hào)分子機(jī)制。 方法： 分別提取8-10周齡ApoE-/-和ApoE-/-;Anti-ACT1雄性小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，用oxLDL（80ug/ml）處理24h后檢測(cè)清道夫受體（CD36和SR-A）以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABCA1/ABCG1）的表達(dá)變化，并用western blot加以驗(yàn)證。另外，體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞株（THP-1），經(jīng)PMA誘導(dǎo)后貼壁轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，用oxLDL誘導(dǎo)24h和48h，檢測(cè)ACT1及吞噬相關(guān)基因和蛋白水平的變化。進(jìn)一步用siRNAACT1對(duì)THP-1細(xì)胞中ACT1進(jìn)行抑制觀察oxLDL誘導(dǎo)48h后對(duì)MAPKs和NF-κB相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)作用，最后，用NF-κB抑制劑，oxLDL誘導(dǎo)48小時(shí)后，觀察泡沫細(xì)胞形成情況以及其對(duì)MAPKs和CD36的作用。 結(jié)果： 1與ApoE-/-小鼠相比，，ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠巨噬細(xì)胞在oxLDL誘導(dǎo)后，CD36的mRNA水平明顯降低。 2與對(duì)照組相比，THP-1細(xì)胞經(jīng)oxLDL處理24h和48h后均可誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，且CD36和ACT1蛋白水平在處理48h后均明顯提高。 3.在THP-1細(xì)胞中，ACT1siRNA后對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成數(shù)量較單純oxLDL處理組明顯降低，同時(shí)CD36，p-P65，p-P38，p-JNK和JNK2的表達(dá)均明顯降低。 4.與單純oxLDL處理組相比，外源性NF-κB抑制劑（PDTC）對(duì)oxLDL誘導(dǎo)48h后的THP-1泡沫細(xì)胞形成無明顯抑制作用，且對(duì)p-P38磷酸化水平和CD36的表達(dá)也無顯著影響，但可顯著抑制p-P65磷酸化水平和p-JNK和JNK2蛋白水平。 5. ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，高脂誘導(dǎo)后ApoE-/-小鼠血清中IL-17的水平隨動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展有逐漸降低的趨勢(shì)，且高脂誘導(dǎo)8周后ApoE-/-小鼠血清中的IL-17水平與ApoE-/-; Anti-ACT1小鼠相比，無顯著差異。 結(jié)論： 1. ACT1參與oxLDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成。 2. ACT1介導(dǎo)泡沫形成可能主要通過調(diào)控下游的p38，JNK蛋白磷酸化影響CD36的表達(dá)進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞對(duì)oxLDL的吞噬。 3.ACT1介導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成可能不依賴IL-17/ACT1/NF-κB經(jīng)典炎癥信號(hào)途徑活化，而是ACT1可能直接通過調(diào)控MAPKs磷酸化水平調(diào)控CD36表達(dá)影響泡沫細(xì)胞形成。
【關(guān)鍵詞】：動(dòng)脈粥樣硬化 NF-κB 活化因子1 ApoE-/-小鼠 巨噬細(xì)胞 腹腔巨噬細(xì)胞 泡沫細(xì)胞 dil-oxLDL 巨噬細(xì)胞 THP-1 JNK p-38MAPK NF-kB CD36 ACT1
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-22
• 1. 動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展14-16
• 2. 動(dòng)脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞形成16-18
• 3. ACT1在炎癥及免疫反應(yīng)中的作用18-20
• 4. IL-17A與動(dòng)脈粥樣硬化20-22
• 第一章 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)對(duì) ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響22-39
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 1.1.3 主要試劑23
• 1.1.4 主要抗體23-24
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 1.2.1 動(dòng)物的鑒定與飼養(yǎng)24-28
• 1.2.3 基因工程小鼠的擴(kuò)群繁殖及動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立28-29
• 1.2.4 血脂分析29
• 1.2.5 主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的評(píng)價(jià)29-31
• 1.2.6 免疫組化和免疫熒光染色31-33
• 1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析33
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-37
• 1.3.1 Antisense-ACT1(Anti-ACT1)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)的影響33-34
• 1.3.2 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)對(duì) ApoE-/-小鼠體重的影響34
• 1.3.3 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)對(duì)高脂誘導(dǎo)的不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血脂水平的影響34-35
• 1.3.4 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)對(duì) ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響35-36
• 1.3.5 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞浸潤的影響36-37
• 1.3.6 ACT1 蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)及定位37
• 1.4 本章小結(jié)37-39
• 第二章 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響39-44
• 2.1 材料39-40
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞39
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器39-40
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑40
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法40-41
• 2.2.1 動(dòng)物的飼養(yǎng)與鑒定40
• 2.2.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的獲取40
• 2.2.3 腹腔巨噬細(xì)胞體外 oxLDL 誘導(dǎo)泡沫化形成模型的建立40-41
• 2.2.4 泡沫化細(xì)胞鑒定41
• 2.2.5 巨噬細(xì)胞攝取 oxLDL 的實(shí)驗(yàn)41
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析41
• 2.3 結(jié)果41-43
• 2.3.1 抑制 ACT1 表達(dá)對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬 oxLDL 的影響41-42
• 2.3.2 抑制 ACT1 表達(dá)對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞泡沫化形成的影響42-43
• 2.4 本章小結(jié)43-44
• 第三章 特異性抑制巨噬細(xì)胞 ACT1 表達(dá)在減輕泡沫細(xì)胞形成中的機(jī)制研究44-61
• 3.1 材料44-46
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞44
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器44-45
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑45-46
• 3.1.4 主要抗體46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法46-53
• 3.2.1 腹腔巨噬細(xì)胞總 RNA 的提取46
• 3.2.2 RNA 的反轉(zhuǎn)錄及 qPCR46-47
• 3.2.3 人單核細(xì)胞株 THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)47-48
• 3.2.4 針對(duì) ACT1 蛋白的 siRNA 鏈干擾效率篩選48
• 3.2.5 THP-1 細(xì)胞總 RNA 的提取48-49
• 3.2.6 利用 oxLDL 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞建立泡沫化細(xì)胞模型49
• 3.2.7 RNA 的反轉(zhuǎn)錄及 qPCR49
• 3.2.8 Western blot49-52
• 3.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析52-53
• 3.3 結(jié)果53-59
• 3.3.1 抑制 ACT1 表達(dá)對(duì)清道夫受體及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響53-54
• 3.3.2 THP-1 泡沫細(xì)胞模型評(píng)價(jià)54
• 3.3.3 單核細(xì)胞 THP-1 源巨噬細(xì)胞中 ACT1 與 CD36 的表達(dá)變化54-55
• 3.3.4 siRNA ACT1 對(duì) THP-1 細(xì)胞泡沫化的影響55-56
• 3.3.5 siRNA ACT1 對(duì) THP-1 細(xì)胞中泡沫化形成相關(guān)信號(hào)蛋白分子表達(dá)的影響56-57
• 3.3.6 外源性抑制 NF-κB 對(duì) THP-1 細(xì)胞泡沫化及相關(guān)信號(hào)蛋白分子表達(dá)的影響57-58
• 3.3.7 IL-17 在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的變化58-59
• 3.4 本章小結(jié)59-61
• 討論61-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 攻讀碩士研究生學(xué)位期間發(fā)表的論文69
• 附錄一：縮寫詞中英文對(duì)照69-70
• 致謝70-71

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4 劉灝;巨噬細(xì)胞再極化[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

5 高飛;年齡相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化對(duì)骨修復(fù)再生作用的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

6 劉芳;ABCG1基因表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞功能影響及在動(dòng)脈粥樣硬化中作用的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

7 周江睿;神經(jīng)肽Y對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子和小分子炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

8 趙魯杭;黃芪多糖的制備及其對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響[D];浙江大學(xué);2011年

9 潘宇飛;信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞功能的作用與機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 陸寧;巨噬細(xì)胞中表皮生長因子受體激活對(duì)細(xì)胞因子及實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的調(diào)節(jié)作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣璐;運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞游離鐵代謝的影響及機(jī)制探討[D];江蘇大學(xué);2007年

2 朵瑞雪;免疫突觸的形成對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中巨噬細(xì)胞凋亡率影響的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 劉丹霞;結(jié)核桿菌對(duì)感染宿主巨噬細(xì)胞應(yīng)激的調(diào)控作用及其機(jī)制研究[D];石河子大學(xué);2013年

4 陳南鵬;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];暨南大學(xué);2011年

5 謝燕霞;蘆筍多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)研究[D];山東師范大學(xué);2008年

6 劉譯聰;巴西天然蜂膠對(duì)牙齦卟啉單胞菌激活的巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控及機(jī)制探討[D];吉林大學(xué);2014年

7 文明智;紅霉素對(duì)香煙刺激的人巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

8 葉金善;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

9 閆坤;前列腺素E1對(duì)小鼠子宮巨噬細(xì)胞表型和功能活性的影響[D];河南師范大學(xué);2011年

10 汪韶君;扇貝裙邊糖胺聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞脂蛋白代謝及脂蛋白受體表達(dá)的影響研究[D];青島大學(xué);2006年

本文編號(hào)：1062116