本文關(guān)鍵詞：利用VBIM系統(tǒng)篩選與EV71感染相關(guān)的宿主細胞因子

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【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是引起于足口病的重要病原體。近年來手足口病發(fā)病數(shù)和報告死亡病例數(shù)已居我國丙類傳染病首位,成為迫切需要解決的公共衛(wèi)生問題。目前EV71的致病機制尚未完全清楚,尚無特異性抗病毒治療措施。尋找EV71感染細胞的相關(guān)宿主基因,對于明確EV71的致病機制,尋找有效的抗EV71藥物靶標具有非常重要的意義。 基于慢病毒的可驗證插入突變(Validation-Based Insertional Mutagenesis, VBIM)系統(tǒng)是一種前向遺傳學(xué)方法,已在哺乳動物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究領(lǐng)域有比較成熟的應(yīng)用,但多集中在腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域。本課題將VBIM系統(tǒng)引入病毒學(xué)研究領(lǐng)域,并在哺乳動物細胞中開展了基于表型和功能的基因組學(xué)篩選,以期得到EV71生活周期所需的宿主因子和抑制EV71復(fù)制的宿主限制性因子。 我們首先以VBIM系統(tǒng)的三種載體質(zhì)�！猇BIM-SD1/SD2/SD3分別包裝慢病毒感染RD細胞,獲得因VBIM-SD載體插入細胞基因組而產(chǎn)生的突變池；再以EV71病毒為篩選壓力,獲得了數(shù)個抵抗EV71感染的細胞克�。焕镁幋aCre重組酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞,對細胞克隆中突變表型的可逆性進行檢測,發(fā)現(xiàn)其中SD2-2細胞克隆的突變表型與VBIM-SD載體在宿主細胞基因組的插入突變有關(guān)；利用inverse PCR擴增SD2-2細胞中VBIM載體插入位點兩側(cè)的基因序列并進行測序,我們證明SD2-2細胞克隆中VBIM的插入位點位于核孔蛋白Nup214的第十四內(nèi)含子中。進一步的研究表明,在SD2-2細胞克隆中,VBIM序列為反向插入并導(dǎo)致該突變細胞株中內(nèi)源性核孔蛋白Nup214的表達明顯降低,而當SD2-2細胞克隆中VBIM插入序列被Cre重組酶切除后,Nup214的表達及該細胞克隆對EV71的敏感性都得以回復(fù),提示Nup214可能是EV71在RD細胞中復(fù)制所需的宿主因子。通過在HEK293T細胞中過表達Nup214,我們發(fā)現(xiàn)Nup214可以促進EV71的復(fù)制,進一步證明Nup214在EV71復(fù)制過程中的作用,表明我們通過VBIM系統(tǒng)篩選與病毒感染相關(guān)的宿主因子是可靠的。 本課題首次將VBIM系統(tǒng)引入病毒學(xué)研究,以EV71感染RD細胞為模型,利用這一可控、可逆的高效慢病毒啟動子插入法在全基因組范圍隨機進行插入突變,發(fā)現(xiàn)了一個與EV71感染相關(guān)的宿主因子—Nup214。這一新的病毒感染相關(guān)基因篩選平臺的建立,為進一步研究病毒與宿主相互作用提供了新思路和新手段。
【關(guān)鍵詞】：插入突變 VBIM 腸道病毒71型 反向PCR 核孔蛋白Nup214
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 前言8-10
• 材料與方法10-31
• 1 材料10-18
• 1.1 細胞和病毒10
• 1.2 質(zhì)粒10-12
• 1.3 生化試劑12-13
• 1.4 主要試劑盒13-14
• 1.5 抗體14
• 1.6 工具酶14
• 1.7 溶液14-16
• 1.8 引物序列16-17
• 1.9 主要儀器17-18
• 1.10 數(shù)據(jù)處理和分析軟件18
• 2 方法18-29
• 2.1 細胞培養(yǎng)18
• 2.2 假病毒的包裝與感染18-19
• 2.3 貼壁細胞全蛋白的抽提19
• 2.4 蛋白定量分析19-20
• 2.5 Western Blot檢測蛋白質(zhì)的表達20-22
• 2.6 免疫熒光22
• 2.7 基因組的提取22-23
• 2.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化23
• 2.9 質(zhì)粒的中量提取和純化23-24
• 2.10 配制瓊脂糖凝膠24
• 2.11 反轉(zhuǎn)錄PCR24-25
• 2.12 inverse PCR25-27
• 2.13 DNA電泳凝膠回收27-28
• 2.14 過表達帶血凝素標簽的Nup214蛋白的載體構(gòu)建28-29
• 2.15 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染29
• 3 技術(shù)方案29-31
• 研究結(jié)果31-43
• 1 以EV71感染致死為選擇壓力,利用VBIM系統(tǒng)篩選獲得抵抗EV71感染的突變細胞克隆31-33
• 1.1 VBIM系統(tǒng)慢病毒的包裝31
• 1.2 VBIM慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)RD細胞31-32
• 1.3 以EV71病毒為篩選壓力,篩選獲得抗EV71感染的突變細跑株32-33
• 2 利用CRE重組酶切除篩選細胞克隆中VBIM,驗證因VBIM插入所致突變克隆的可逆性33-37
• 2.1 構(gòu)建pMSCV-Cre-Puro病毒表達載體33
• 2.2 包裝MSCV-Cre-puro逆轉(zhuǎn)錄病毒,在感染細胞中表達Cre重組酶33-34
• 2.3 通過觀測表型回復(fù)確定突變細胞株表型是因VBIM的插入所致34-37
• 3 與EV71感染相關(guān)的宿主基因的發(fā)現(xiàn)37-38
• 4 對SD2-2突變細胞株基因組擴增產(chǎn)物——NUP214的分析38-41
• 4.1 SD2-2中VBIM插入方向的鑒定40
• 4.2 SD2-2中Nup214表達水平的檢測40-41
• 5 在HEK293T中過表達NUP214可以促進EV71的復(fù)制41-43
• 5.1 構(gòu)建帶HA標簽的表達載體41-42
• 5.2 過表達Nup214可以增強EV71病毒在HEK293T細孢中的復(fù)制42-43
• 討論43-46
• 結(jié)論46-50
• 綜述50-65
• 綜述參考文獻60-65
• 英文縮略語對照表65-68
• 個人簡歷68
• 發(fā)表文章68-69
• 致謝69-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 揚帆 ,金奇 ,何雅青 ,李良成 ,候云德;The complete genome of Enterovirus 71 China strain[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2001年02期

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本文編號：1053336