本文關鍵詞：Erbin與Plk1激酶相互作用的研究

  更多相關文章： Erbin Plk1 細胞周期 有絲分裂 磷酸化 腫瘤

【摘要】：研究背景：有絲分裂是細胞生命活動的重要特征之一，從十九世紀末發(fā)現至今一直受到科學家的高度重視和關注，經過漫長的探索和研究，科學家們發(fā)現細胞有絲分裂是受時間和空間上的復雜、精巧的調控過程。細胞有絲分裂異常會導致非整倍體（aueuploidy）細胞的增加，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切的聯系。 經漫長的進化過程，細胞具備了能保證細胞周期DNA復制和染色體分配順利完成的檢查機制，被稱為細胞周期檢查點（cell cycle checkpoints）。細胞周期檢查點的調控機制是保證細胞周期事件按次序、正常發(fā)生的細胞周期調控機制，也是細胞周期調控的關鍵因素。細胞周期檢查點的調控主要通過一系列酶來完成的，根據文獻報道，，參與細胞有絲分裂重要的調控酶類主要有：Plk1，Cdk1等細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs），PP1，Cdc14等細胞周期的磷酸酶，紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC）和E3泛素連接酶后期促進復合體等相關分子。 Plk1（Polo-like kinase1）是細胞周期有絲分裂重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在細胞有絲分裂進程中發(fā)揮極其重要的作用，在細胞周期不同亞期Plk1定位不同。到目前為止，已經揭示有幾十個Plk1的底物，Plk1通過與這些底物相互作用來影響細胞周期有絲分裂的進入、紡錘體的形成、姐妹染色單體間的分離、中心體的復制以及胞質分裂的過程；另外，Plk1本身的亞細胞定位也受相應底物的調控。在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，最主要的表現為細胞增殖異常和遷移能力的增加，激酶Plk1是調控細胞有絲分裂的關鍵分子，經大量的研究證實在腫瘤細胞中Plk1具有明顯的高表達；在體外細胞培養(yǎng)和動物實驗中，低表達Plk1能夠有效地抑制腫瘤細胞的增殖并促進其自身凋亡，但對正常細胞沒有明顯的影響。因此，在人類腫瘤的治療中，Plk1激酶的靶向治療很可能成為的潛在新方法。 Erbin（ErbB2Interacting protein）定位于細胞膜和相鄰細胞連接處，最早在2000年以癌基因ErbB2為誘餌通過酵母雙雜交實驗時被發(fā)現，并因此而命名。我們實驗室早期自主制備了Erbin抗體，在檢測Erbin抗體做免疫熒光時發(fā)現，Erbin具有細胞周期依賴性表達升高和有絲分裂亞細胞動態(tài)定位的特征，這些研究結果提示Erbin在細胞周期中對細胞有絲分裂可能具有重要的調控作用。我們也發(fā)現Erbin具有有絲分裂依賴的磷酸化修飾特征，其磷酸化發(fā)生與Plk1的激活時程（time pattern）相似，且在細胞周期有絲分裂中存在明顯的亞細胞共定位（中心體和中體），由此提示Erbin可能是Plk1新的底物蛋白；因此，本課題擬通過分析Plk1與Erbin的相互作用，探討Erbin作為Plk1新的底物蛋白對細胞有絲分裂的調控作用及機制。 目的：在細胞水平上研究Erbin是否具有細胞周期依賴性的表達及其磷酸化，在細胞有絲分裂周期中Erbin亞細胞定位的變化，揭示Plk1對Erbin磷酸化的影響及其在細胞有絲分裂中亞細胞共定位，Erbin與Plk1相互作用的結構域。初步探索Erbin對細胞有絲分裂的影響。 方法：通過細胞周期同步化實驗進一步觀察Erbin細胞周期依賴性的表達及其磷酸化特征，研究Erbin與Plk1在細胞有絲分裂中磷酸化的關系。利用免疫熒光（IF）檢測細胞周期中Erbin亞細胞定位的動態(tài)變化特征，檢測Erbin與Plk1在細胞周期有絲分裂中的共定位作用，檢測內源和外源Erbin與Plk1相互作用的定位基礎，檢測Erbin不同截斷體的定位從而確定Erbin的核定位基礎。利用分子生物學技術構建相應的載體，經免疫共沉淀（Co-IP）實驗初步證實內源和外源Erbin與Plk1存在相互作用，利用Erbin和Plk1的不同結構域的截斷體進一步證實Erbin與Plk1相互作用的結構域，并且經過GST-Pull down實驗進一步佐證Erbin與Plk1的相互作用及其二者相互作用的結構域。經過序列比對分析實驗，推測并證實Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的點火激酶。利用ErbinsiRNA干涉實驗證明Erbin敲低對Plk1磷酸化的影響；利用流式細胞術，經Nocodazole同步化（M）釋放實驗，PI染色檢測Erbin siRNA干涉后對細胞周期的影響；經DAPI和Golgin-97染色細胞核和高爾基體，檢測Erbin敲低對細胞有絲分裂細胞核的影響；在正常人乳腺細胞MCF-10A中敲低Erbin表達，在倒置顯微鏡下有絲分裂細胞數的變化。 結果：首先我們利用抗微管藥物Nocodazole處理細胞使細胞阻滯于G2/M期，分析G2/M期細胞裂解樣品中Erbin蛋白在電泳中的泳動，結果觀察到其遷移明顯變緩，而在λ磷酸酶處理可以翻轉Nocodazole引起的Erbin條帶遷移變緩現象，證實磷酸化修飾是引起Erbin在G2/M期條帶上移的原因，進一步用雙胸腺嘧啶使細胞阻滯于G1/S期，然后釋放，觀察細胞在自然進入M期時Erbin條帶泳動的變化，結果發(fā)現Erbin在從G2進入M期（T9-T11）時條帶明顯上移，并與激酶Plk1的活化pattern一致；而敲低Plk1可抑制Nocodazole引起的Erbin條帶上移，表達激活型Plk1和野生型Plk1可直接導致外源表達的Erbin條帶上移（轉染失活型的Plk1無此作用），以上實驗結果證實M期Erbin磷酸化依賴于激酶Plk1。此外我們亦初步證實Cdk1是Plk1磷酸化Erbin的點火激酶。進一步我們利用免疫熒光觀察細胞周期中的Erbin具有明顯的中體和中心體定位，在有絲分裂前、中期Erbin與Plk1在中心體具有明顯的共定位，在末期和胞質分裂期兩者在中體有明顯的共定位。免疫共沉淀實驗證實Erbin-PDZ結構域與Plk1的催化區(qū)（Plk1-CD）相互作用，而Erbin-Inter區(qū)只與活化的Plk1發(fā)生相互作用。并GST-Pull down實驗亦進一步佐證Erbin與Plk1的相互作用，即Erbin-PDZ不與Plk1-PBD結合，而與Plk1-CD結合，而Plk1-PBD與磷酸化的Erbin-Inter區(qū)有更強的體外作用。這些相互作用實驗結果提示，Erbin是Plk1新的底物，Erbin被磷酸化的底物區(qū)域存在于Erbin-Inter區(qū)，而Erbin-PDZ可能調控Plk1的活性。我們亦進一步證實了過表達PDZ對Plk1磷酸化的抑制作用和延緩有絲分裂進入。我們也觀察到慢病毒感染敲低Erbin15天后，細胞明顯分裂異常，主要表現為多核細胞顯著增強。 結論：本研究證明了Erbin具有細胞周期依賴性的表達及細胞周期有絲分裂的亞細胞定位動態(tài)特征，并且具有有絲分裂依賴的磷酸化修飾現象，與Plk1激酶存在明顯的相互作用，并且初步驗證Cdk1是Plk1磷酸化Erbin中的“點火”（priming）激酶，Plk1磷酸化Erbin的底物結合區(qū)存在于Erbin-Inter區(qū)，而Erbin-PDZ結構域通過與Plk1-CD結構域結合，可能空間位阻上干擾Plk1T210的激活。以上結果提示，Erbin即作為Plk1的底物又可負調控Plk1活性，Erbin是一個重要的新的有絲分裂調控分子。Erbin敲低明顯促進了細胞的增殖以及多核細胞的產生，Erbin失調介導細胞周期異�？赡芘c腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。進一步揭示Erbin-PDZ介導的負調控Plk1的分子機制，可能為探索新的Plk1抑制分子藥物提供極有價值的信息。
【關鍵詞】：Erbin Plk1 細胞周期 有絲分裂 磷酸化 腫瘤
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329;Q253
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 縮略詞表13-15
• 引言15-19
• 第一部分 Plk1 依賴的 Erbin 磷酸化及其相互作用19-43
• 摘要19-21
• 1.1 前言21-22
• 1.2 材料22-23
• 1.2.1 實驗細胞22
• 1.2.2 實驗試劑22-23
• 1.2.3 表達載體及質粒23
• 1.2.4 主要儀器設備23
• 1.2.5 其它常用常規(guī)試劑參考《分子克隆實驗指南》（第二版）配制23
• 1.3 方法23-28
• 1.3.1 細胞的培養(yǎng)23-24
• 1.3.2 細胞周期的同步化法一24
• 1.3.3 質粒在細胞中的過表達24-25
• 1.3.4 siRNA 干涉25-26
• 1.3.5 免疫印跡（Western blot）檢測26
• 1.3.6 免疫熒光（IF）26-27
• 1.3.7 免疫共沉淀（Co-IP）27-28
• 1.3.8 GST 沉淀實驗（GST pull-down）28
• 1.4 結果28-37
• 1.4.1 G2/M 期 Erbin 發(fā)生磷酸化修飾28-29
• 1.4.2 M 期 Erbin 磷酸化依賴于激酶 Plk129-31
• 1.4.3 Erbin 在細胞周期有絲分裂中的定位變化31
• 1.4.4 Erbin 與 Plk1 的相互作用31-33
• 1.4.5 Erbin 的核定位基礎33
• 1.4.6 Erbin-PDZ 與 Plk1 的共定位以及 Plk1 磷酸化 Erbin 的點火激酶33-35
• 1.4.7 Erbin 與 Plk1 的相互作用 Mapping35-37
• 1.5 結論37-39
• 參考文獻39-43
• 第二部分 干涉 Erbin 對細胞有絲分裂的影響及其生物學意義43-57
• 摘要43-44
• 2.1 前言44-45
• 2.2 材料45-46
• 2.2.1 實驗細胞45
• 2.2.2 實驗試劑45
• 2.2.3 主要儀器設備45
• 2.2.4 其它常用常規(guī)試劑參考《分子克隆實驗指南》（第二版）配制45-46
• 2.3 方法46-49
• 2.3.1 細胞的培養(yǎng)46
• 2.3.2 免疫印跡(Western blot)46
• 2.3.3 細胞周期的同步化法二46-47
• 2.3.4 流式細胞術47-48
• 2.3.5 慢病毒感染48
• 2.3.6 DAPI+Golgin-97 染色48-49
• 2.4 結果49-53
• 2.4.1 Erbin 敲低促進了 Plk1 的磷酸化及細胞有絲分裂的進入49-51
• 2.4.2 敲低 Erbin 不影響細胞的出有絲分裂51-52
• 2.4.3 敲低 Erbin 表達誘導多核細胞的產生52-53
• 2.4.4 敲低 Erbin 表達促進了細胞的增殖53
• 2.5 結論53-55
• 參考文獻55-57
• 文獻綜述57-84
• 摘要57
• 1 背景57-58
• 2 Plk1 在不同亞細胞結構中的募集58-59
• 3 Plk1 在中心體中的功能59-61
• 4 Plk1 在著絲粒中的功能61-63
• 5 Plk1 在細胞分裂后期和末期未知的功能63-64
• 6 在胞質分裂期完成細胞的分離64-66
• 7 Polo-like Kinase 1 在胞質分裂中的定位66-67
• 8 Plk1 通過 RhoGEF 蛋白 Ect2 和 GTPase RhoA 控制胞質分裂的起始67-68
• 9 Plk1 控制胞質分離兩種可能方式68-69
• 10 Plk1 的新功能和胞質分離時期有絲分裂激酶的聯系69-71
• 11 Cdk1 指導 Plk1 募集到紡錘體的中間區(qū)域71-72
• 12 在后期 B 增加姐妹紡錘體之間的延伸距離72-73
• 13 在細胞分裂期酵母和人類的 Polo 和 Rho 是保守的連接嗎？73-74
• 14 Plk1 作為癌癥治療中的一個靶點74-75
• 15 展望75-77
• 參考文獻77-84
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄84-85
• 致謝85-87

【共引文獻】

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本文編號：1052062