本文關(guān)鍵詞：CRP轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)霍亂弧菌CAI-1合成酶基因cqsA的分子機(jī)制的初步研究及河弧菌的病原學(xué)及分子流行病學(xué)研究

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【摘要】：群體感應(yīng)(Quorum Sensing, QS)是細(xì)菌通過感應(yīng)細(xì)胞密度變化來進(jìn)行細(xì)胞間信息交流的重要機(jī)制。1970年首次在費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri, V. fischeri)中發(fā)現(xiàn),之后證實(shí)在很多細(xì)菌中都存在群體感應(yīng)現(xiàn)象,霍亂弧菌(Vibrio cholerae, V. cholerae)就是其中之一。霍亂是一種由霍亂弧菌引起的烈性傳染病,致劇烈腹瀉并能快速傳播。世界第七次大流行自1961年延續(xù)至今,波及世界五大洲100多個(gè)國家,尚未得到有效控制。這與霍亂弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用息息相關(guān)。霍亂弧菌有三種不同的QS系統(tǒng),包括CAI-1/CqsS, AI-2/LuxPQ和VarS/A-CsrA/BCD系統(tǒng),在霍亂弧菌的致病性和環(huán)境生存等多個(gè)發(fā)面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本研究主要涉及到CAI-1/CqsS系統(tǒng),以CAI-1(cholerae autoinducer1)為信號分子,cqsA為CAI-1合成酶編碼基因,CqsS為CAI-1的膜結(jié)合組氨酸激酶受體(sensor kinase),由cqsS基因編碼。cAMP受體蛋白CRP (cAMP receptor protein, CRP)是一全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子,cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信號分子,cAMP-CRP復(fù)合體可以通過結(jié)合于啟動(dòng)子附近的一段特異的保守序列(TGTGA-N6-TCACA),與RNA聚合酶相互作用來調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄單元,涉及霍亂弧菌的生長代謝,毒力基因表達(dá)調(diào)控和QS系統(tǒng)等多個(gè)方面。 前期研究表明cAMP-CRP復(fù)合體在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)CAI-1合成酶基因cqsA的表達(dá),而缺失cAMP或CRP都會使cqsA mRNA的穩(wěn)定性下降,本研究通過構(gòu)建篩選指標(biāo)簡單的報(bào)告重組菌株系統(tǒng),轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入尋找參與該調(diào)節(jié)過程中的調(diào)控元件和調(diào)控分子。通過自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)構(gòu)建了染色體上單拷貝整合的cqsA-lacZ翻譯融合報(bào)告重組菌株系統(tǒng),cqsA-lacZ融合基因nRNA水平和CAI-1信號分子檢測表明所構(gòu)建的重組菌株系統(tǒng)滿足工作需求,報(bào)告基因lacZ的表達(dá)和菌落藍(lán)白斑表型變化忠實(shí)地反映CRP了對cqsA的調(diào)節(jié)。利用藍(lán)白斑表型指標(biāo)變化,篩選轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變文庫,隨機(jī)引物PCR確定轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn),獲得了若干插入位點(diǎn)基因,有待進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還通過5'RACE的方法確定了cqsA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),位于起始密碼子ATG上游41bp處。 河弧菌是一種食源性傳播的病原菌,在世界范圍內(nèi)已有多次暴發(fā)和散發(fā),尤其在發(fā)展中國家或是衛(wèi)生條件較差的沿海地區(qū)是很嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。本課題對我國分離得到的43株河弧菌主要的毒力因子,病原學(xué)及分子流行病學(xué)特征進(jìn)行了描述分析。 通過PCR檢測了43株河弧菌株毒力基因、新陳代謝相關(guān)基因以及耐藥相關(guān)基因的攜帶狀況,并在分子水平上證實(shí)了一株精氨酸雙水解酶基因缺失河弧菌株的存在。雖然所有菌株均檢測到了毒力基因vfh, hupO和vfpA的存在,但每株菌產(chǎn)生溶血素、細(xì)胞毒素、蛋白酶的水平以及形成生物膜的能力則各有不同。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們對β-內(nèi)酰胺類、阿奇霉素及磺胺類藥物有較強(qiáng)的耐藥性,27%的菌株能夠同時(shí)對兩種或兩種以上的抗生素耐藥；而PFGE分析發(fā)現(xiàn)這些菌株間無明顯親緣關(guān)系,呈現(xiàn)高度多樣性。 本研究首次對我國分離得到的河弧菌菌株的病原學(xué)及分子流行病學(xué)特征進(jìn)行了比較系統(tǒng)的描述分析,發(fā)現(xiàn)了一些較為少見的生化特點(diǎn)。無論來源于病人還是環(huán)境的菌株均攜帶有毒力基因,但毒力因子的表達(dá)情況則各不相同。鑒于河弧菌可引起腹瀉暴發(fā)流行,具有有公共衛(wèi)生的風(fēng)險(xiǎn),在以后的工作中我們應(yīng)系統(tǒng)的收集引起暴發(fā)或散發(fā)病例的河弧菌株及其相關(guān)的流行學(xué)信息,進(jìn)一步拓展對其致病性和感染的流行病學(xué)特征的了解和認(rèn)識。
【關(guān)鍵詞】：霍亂弧菌 CRP cqsA CAI-1 翻譯融合 轉(zhuǎn)座子 河弧菌 細(xì)胞毒性 藥敏 毒力因子 PFGE 生物膜
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.3
【目錄】：

• 目錄4-6
• 縮略詞6-7
• 第一部分7-36
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-16
• 材料與方法16-26
• 一. 材料16-17
• 二. 基本操作方法17-19
• 三. RNA相關(guān)操作19-21
• 四. 構(gòu)建cqsA與VC2338(V.cholerae lacZ編碼基因)翻譯融合的重組菌株CLP4和WLP421
• 五. 構(gòu)建cqsA與大腸桿菌lacZ基因翻譯融合的重組菌株W△LP5和C△LP521-23
• 六. 構(gòu)建crp基因回補(bǔ)菌株W△LP5-crp和WLP4-crp23
• 七. 構(gòu)建的各菌株驗(yàn)證23-24
• 八. 利用轉(zhuǎn)座子技術(shù)構(gòu)建插入不同位點(diǎn)的突變體文庫24-26
• 結(jié)果26-31
• 一、5'RACE確定cqsA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)26
• 二、cqsA與VC2338基因翻譯融合的重組菌株CLP4和WLP4的構(gòu)建26-27
• 三、cqsA與大腸桿菌lacZ基因翻譯融合的重組菌株W△LP5和C△LP5的構(gòu)建27
• 四、crp基因回補(bǔ)菌株W△LP5-crp和WLP4-crp的構(gòu)建27-28
• 五、構(gòu)建菌株的驗(yàn)證28-29
• 六、利用轉(zhuǎn)座子技術(shù)構(gòu)建插入不同位點(diǎn)的突變體文庫29-31
• 討論31-33
• 小結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 第二部分36-63
• 中文摘要37-38
• Abstract38-39
• 前言39-41
• 材料與方法41-51
• 一. 材料41-43
• 二. 實(shí)驗(yàn)方法43-51
• 結(jié)果和討論51-59
• 一、河弧菌的生化特性分析51-53
• 二、河弧菌毒力表型及其編碼基因檢測53-54
• 三、河弧菌的細(xì)胞毒性分析54-55
• 四、河弧菌生物膜形成能力分析55
• 五、河弧菌的藥物敏感性分析55-57
• 六、河弧菌的PFGE結(jié)果分析57-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 附錄 1.44 株河弧菌的生化表型及基因檢測結(jié)果匯總63-65
• 綜述65-78
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 致謝78

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 吳斌,馬杰,林維宣;水產(chǎn)品中致病性弧菌的分離與鑒定[J];大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年01期

2 韓善橋,馬驄,陸曉白,郝秀紅;我國沿海地區(qū)海水中致病性弧菌的調(diào)查[J];海軍總醫(yī)院學(xué)報(bào);2003年04期

3 紀(jì)榮興,胡石柳,鄒文政,張坤寧;美國紅魚“腐皮病”病原的初步研究[J];海洋科學(xué);2003年08期

4 張曉逸;一起河弧菌和豚鼠氣單胞菌引起的食物中毒調(diào)查[J];江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué);2003年02期

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本文編號：1048952