本文關鍵詞：CRP轉錄后水平調節(jié)霍亂弧菌CAI-1合成酶基因cqsA的分子機制的初步研究及河弧菌的病原學及分子流行病學研究

  更多相關文章： 霍亂弧菌 CRP cqsA CAI-1 翻譯融合 轉座子 河弧菌 細胞毒性 藥敏 毒力因子 PFGE 生物膜

【摘要】：群體感應(Quorum Sensing, QS)是細菌通過感應細胞密度變化來進行細胞間信息交流的重要機制。1970年首次在費氏弧菌(Vibrio fischeri, V. fischeri)中發(fā)現(xiàn),之后證實在很多細菌中都存在群體感應現(xiàn)象,霍亂弧菌(Vibrio cholerae, V. cholerae)就是其中之一�；魜y是一種由霍亂弧菌引起的烈性傳染病,致劇烈腹瀉并能快速傳播。世界第七次大流行自1961年延續(xù)至今,波及世界五大洲100多個國家,尚未得到有效控制。這與霍亂弧菌群體感應系統(tǒng)的調控作用息息相關�；魜y弧菌有三種不同的QS系統(tǒng),包括CAI-1/CqsS, AI-2/LuxPQ和VarS/A-CsrA/BCD系統(tǒng),在霍亂弧菌的致病性和環(huán)境生存等多個發(fā)面發(fā)揮重要的調節(jié)作用。本研究主要涉及到CAI-1/CqsS系統(tǒng),以CAI-1(cholerae autoinducer1)為信號分子,cqsA為CAI-1合成酶編碼基因,CqsS為CAI-1的膜結合組氨酸激酶受體(sensor kinase),由cqsS基因編碼。cAMP受體蛋白CRP (cAMP receptor protein, CRP)是一全局性的轉錄調節(jié)子,cAMP是細胞內重要的第二信號分子,cAMP-CRP復合體可以通過結合于啟動子附近的一段特異的保守序列(TGTGA-N6-TCACA),與RNA聚合酶相互作用來調節(jié)多種轉錄單元,涉及霍亂弧菌的生長代謝,毒力基因表達調控和QS系統(tǒng)等多個方面。 前期研究表明cAMP-CRP復合體在轉錄后水平調節(jié)CAI-1合成酶基因cqsA的表達,而缺失cAMP或CRP都會使cqsA mRNA的穩(wěn)定性下降,本研究通過構建篩選指標簡單的報告重組菌株系統(tǒng),轉座子隨機插入尋找參與該調節(jié)過程中的調控元件和調控分子。通過自殺質粒介導的同源重組技術構建了染色體上單拷貝整合的cqsA-lacZ翻譯融合報告重組菌株系統(tǒng),cqsA-lacZ融合基因nRNA水平和CAI-1信號分子檢測表明所構建的重組菌株系統(tǒng)滿足工作需求,報告基因lacZ的表達和菌落藍白斑表型變化忠實地反映CRP了對cqsA的調節(jié)。利用藍白斑表型指標變化,篩選轉座子隨機插入突變文庫,隨機引物PCR確定轉座子的插入位點,獲得了若干插入位點基因,有待進一步證實。同時本實驗還通過5'RACE的方法確定了cqsA基因的轉錄起始位點,位于起始密碼子ATG上游41bp處。 河弧菌是一種食源性傳播的病原菌,在世界范圍內已有多次暴發(fā)和散發(fā),尤其在發(fā)展中國家或是衛(wèi)生條件較差的沿海地區(qū)是很嚴峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。本課題對我國分離得到的43株河弧菌主要的毒力因子,病原學及分子流行病學特征進行了描述分析。 通過PCR檢測了43株河弧菌株毒力基因、新陳代謝相關基因以及耐藥相關基因的攜帶狀況,并在分子水平上證實了一株精氨酸雙水解酶基因缺失河弧菌株的存在。雖然所有菌株均檢測到了毒力基因vfh, hupO和vfpA的存在,但每株菌產(chǎn)生溶血素、細胞毒素、蛋白酶的水平以及形成生物膜的能力則各有不同。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)它們對β-內酰胺類、阿奇霉素及磺胺類藥物有較強的耐藥性,27%的菌株能夠同時對兩種或兩種以上的抗生素耐藥；而PFGE分析發(fā)現(xiàn)這些菌株間無明顯親緣關系,呈現(xiàn)高度多樣性。 本研究首次對我國分離得到的河弧菌菌株的病原學及分子流行病學特征進行了比較系統(tǒng)的描述分析,發(fā)現(xiàn)了一些較為少見的生化特點。無論來源于病人還是環(huán)境的菌株均攜帶有毒力基因,但毒力因子的表達情況則各不相同。鑒于河弧菌可引起腹瀉暴發(fā)流行,具有有公共衛(wèi)生的風險,在以后的工作中我們應系統(tǒng)的收集引起暴發(fā)或散發(fā)病例的河弧菌株及其相關的流行學信息,進一步拓展對其致病性和感染的流行病學特征的了解和認識。
【關鍵詞】：霍亂弧菌 CRP cqsA CAI-1 翻譯融合 轉座子 河弧菌 細胞毒性 藥敏 毒力因子 PFGE 生物膜
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.3
【目錄】：

• 目錄4-6
• 縮略詞6-7
• 第一部分7-36
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-16
• 材料與方法16-26
• 一. 材料16-17
• 二. 基本操作方法17-19
• 三. RNA相關操作19-21
• 四. 構建cqsA與VC2338(V.cholerae lacZ編碼基因)翻譯融合的重組菌株CLP4和WLP421
• 五. 構建cqsA與大腸桿菌lacZ基因翻譯融合的重組菌株W△LP5和C△LP521-23
• 六. 構建crp基因回補菌株W△LP5-crp和WLP4-crp23
• 七. 構建的各菌株驗證23-24
• 八. 利用轉座子技術構建插入不同位點的突變體文庫24-26
• 結果26-31
• 一、5'RACE確定cqsA基因的轉錄起始位點26
• 二、cqsA與VC2338基因翻譯融合的重組菌株CLP4和WLP4的構建26-27
• 三、cqsA與大腸桿菌lacZ基因翻譯融合的重組菌株W△LP5和C△LP5的構建27
• 四、crp基因回補菌株W△LP5-crp和WLP4-crp的構建27-28
• 五、構建菌株的驗證28-29
• 六、利用轉座子技術構建插入不同位點的突變體文庫29-31
• 討論31-33
• 小結33-34
• 參考文獻34-36
• 第二部分36-63
• 中文摘要37-38
• Abstract38-39
• 前言39-41
• 材料與方法41-51
• 一. 材料41-43
• 二. 實驗方法43-51
• 結果和討論51-59
• 一、河弧菌的生化特性分析51-53
• 二、河弧菌毒力表型及其編碼基因檢測53-54
• 三、河弧菌的細胞毒性分析54-55
• 四、河弧菌生物膜形成能力分析55
• 五、河弧菌的藥物敏感性分析55-57
• 六、河弧菌的PFGE結果分析57-59
• 小結59-60
• 參考文獻60-63
• 附錄 1.44 株河弧菌的生化表型及基因檢測結果匯總63-65
• 綜述65-78
• 參考文獻73-78
• 致謝78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1048952