本文關(guān)鍵詞：空腸彎曲菌cdtB和cdtC原核表達(dá)及其產(chǎn)物的單克隆抗體制備

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【摘要】：空腸彎曲菌是引起世界各地急性胃腸炎的主要病原菌。感染的病人除了表現(xiàn)出急性、自限性腹瀉外,特定血清型的空腸彎曲菌能引起自身免疫疾病,如格林-巴利綜合癥(GBS)�？漳c彎曲菌有許多致病因子如：黏附、侵襲和產(chǎn)毒素,細(xì)胞致死性腫脹毒素(Cytolethal distendin toxin, CDT)是一種由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素,空腸彎曲菌也能產(chǎn)生這種毒素。CDT由三個(gè)相鄰的cdtA、cdtB和cdtC編碼。CDT毒素具有細(xì)胞毒性,能夠損傷真核細(xì)胞的DNA,使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,最終使受損傷的細(xì)胞腫脹死亡。目前,對(duì)空腸彎曲菌細(xì)胞致死性腫脹毒素功能機(jī)理等研究還不夠深入。本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)cdtB、cdtC基因,純化His-CdtB、His-CdtC、GST-CdtC蛋白,以His-CdtB蛋白為基礎(chǔ),建立檢測(cè)空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法；同時(shí)以GST-CdtB的包涵體和GST-CdtC蛋白為免疫原；His-CdtB, His-CdtC蛋白為檢測(cè)原,利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),制備CdtB和CdtC的單克隆抗體,為CDT毒素功能、診斷技術(shù)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。 一、空腸彎曲菌細(xì)胞致死性腫脹毒素cdtB、cdtC的原核表達(dá) 根據(jù)GenBank上公布的空腸彎曲菌NCTC11168的cdtB和cdtC基因序列設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增不含信號(hào)序列的2個(gè)基因,并與pMD-18T載體連接,酶切、測(cè)序鑒定正確后,將cdtB基因連接到表達(dá)載體pET(30a)和pGEX-6p-1,獲得重組菌BL21(pET-cdtB)和BL21(pGEX-6p-l-cdtB);將cdtC基因連接到表達(dá)載體pET(32a)和pGEX-6p-1,獲得重組菌BL21(pET-cdtC)和BL21(pGEX-6p-l-cdtC)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,離心收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白與預(yù)期大小一致,His-CdtB、GST-CdtB大小為分別為29KD、53KD; His-CdtC、GST-CdtC大小分別為36KD、47KD。利用蛋白質(zhì)的變復(fù)性獲得純化的蛋白His-CdtB和GST-CdtC,利用親和層析柱純化獲得His-CdtC。Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。 二、基于CdtB蛋白檢測(cè)空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法建立及初步應(yīng)用 以純化的His-CdtB作為包被原,用NCTC11168攻毒獲得的血清作為陽性血清,建立了檢測(cè)空腸彎曲菌CdtB抗體的間接ELISA方法,以方陣實(shí)驗(yàn)對(duì)ELISA條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定了ELISA反應(yīng)條件：抗原包被濃度為16μg/mL;封閉液為10%的馬血清；封閉時(shí)間為37℃,2h；最佳血清稀釋液為PBS；血清稀釋倍數(shù)為1：200；一抗作用時(shí)間為2h；二抗作用濃度為1：10000,作用時(shí)間為1h;顯色時(shí)間為4min。應(yīng)用優(yōu)化的ELISA方法對(duì)60份雞的血清樣品進(jìn)行測(cè)定,并采集相對(duì)應(yīng)的雞肛拭樣品,進(jìn)行細(xì)菌分離。結(jié)果顯示分離到20份空腸彎曲菌,對(duì)分離株進(jìn)行cdtB基因檢測(cè),18份呈陽性；ELISA檢測(cè)有14份為陽性,2種實(shí)驗(yàn)方法的符合率為78%;應(yīng)用建立的方法對(duì)388份人的血清樣品進(jìn)行測(cè)定,34份呈陽性,陽性率為8.76%。該檢測(cè)方法的建立對(duì)空腸彎曲菌的血清流行病學(xué)研究等提供了新方法。 三、CdtB和CdtC單克隆抗體的制備和初步應(yīng)用 以原核表達(dá)的GST-CdtB和GST-CdtC蛋白為免疫原,以His-CdtB、His-CdtC分別為檢測(cè)原,應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。獲得5株穩(wěn)定分泌CdtB抗體的細(xì)胞株,分別命名為1F3、1F5、2E4、2E11、2F2,2E11,單抗亞類為IgG2b,其它4株均為IgGl,腹水效價(jià)分別為1：3276800、1：6553600、1：819200、1：6553600、1：13107200；獲得5株穩(wěn)定分泌CdtC抗體的細(xì)胞株,分別命名為3A10、4D2、2E1、6E4、3G5,單抗亞類均為IgG1；腹水效價(jià)分別為1：6553600、1：3276800、1：1638400、1：13107200、1：1638400。Western-blot分析顯示,每株單抗都能與相對(duì)應(yīng)的融合蛋白發(fā)生發(fā)應(yīng),并出現(xiàn)特異性的條帶,說明單抗具有良好的特異性。 選擇Caco-2和HD-11細(xì)胞為模型,將2種抗體與NCTC11168中和1h后進(jìn)行黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,對(duì)于HD-11細(xì)胞,與2種抗體作用后的細(xì)菌的黏附和侵襲能力相對(duì)于對(duì)照組明顯下降,加入CdtB抗體黏附率和侵襲率分別下降了28%、11%：加入CdtC抗體黏附率和侵襲率分別下降了27%、32%;同時(shí)加入CdtB和CdtC抗體黏附率和侵襲率分別下降了30%、47%；侵染HD-11細(xì)胞后的形態(tài)觀察和細(xì)胞數(shù)目測(cè)定顯示,只加入NCTC11168細(xì)菌的對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)為6.8×15個(gè)/mL；加入CdtB抗體后,活細(xì)胞數(shù)為1.4×106個(gè)/mL；加入CdtB和CdtC抗體后,活細(xì)胞數(shù)為2.6×106個(gè)/mL,加入抗體后的細(xì)胞存活率高于對(duì)照組。對(duì)照組的細(xì)胞明顯腫脹,而加入抗體后的細(xì)胞腫脹數(shù)明顯減少。對(duì)于Caco-2細(xì)胞,加入CdtB抗體,細(xì)菌的黏附和侵襲分別下降了73%、70%；加入CdtC抗體,細(xì)菌的黏附和侵襲分別下降了68%、70%;加入CdtB和CdtC抗體細(xì)菌的黏附和侵襲分別下降了71%、75%。研究顯示CdtB和CdtC抗體具有一定的中和毒素的能力,加入抗體后能干擾細(xì)菌的黏附和侵襲能力。CdtB和CdtC單克隆抗體的制備為研究CdtB和CdtC蛋白的生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用等方面奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：空腸彎曲菌 細(xì)胞致死性腫脹毒素 CdtB CdtC蛋白 ELISA方法 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-8
• 目錄8-10
• 符號(hào)說明10-12
• 綜述 細(xì)胞致死性腫脹毒素12-23
• 1 編碼和/或產(chǎn)生CDT的細(xì)菌種類12-13
• 1.1 大腸桿菌12
• 1.2 志賀氏菌12-13
• 1.3 空腸彎曲桿菌13
• 1.4 其他細(xì)菌13
• 2 CDT的遺傳學(xué)13-14
• 3 CDT結(jié)構(gòu)14
• 4 CDT各組成部分的功能14-16
• 4.1 CdtB的功能14-15
• 4.2 CdtA/CdtC的功能15-16
• 5 CDT的作用機(jī)制16-17
• 6 CDT影響的細(xì)胞類型17
• 7 CDT作為一個(gè)可能的致病因素17-18
• 8 展望18
• 參考文獻(xiàn)18-23
• 第一章 空腸彎曲菌細(xì)胞致死性腫脹毒素cdtB、cdtC的原核表達(dá)23-34
• 1 材料與方法23-26
• 1.1 材料23-24
• 1.2 方法24-26
• 2 結(jié)果26-31
• 2.1 cdtB和cdtC基因擴(kuò)增26-27
• 2.2 PCR產(chǎn)物與克隆載體的連接27
• 2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-cdtB、pGEX-6p-1-cdtB、pET-cdtC、pGEX-6p-1-cdtC的構(gòu)建與鑒定27-28
• 2.4 cdtB,cdtC基因在重組菌中的表達(dá)28-31
• 3 討論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二章 基于CdtB蛋白檢測(cè)空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法建立及初步應(yīng)用34-47
• 1 材料與方法34-36
• 1.1 材料34
• 1.2 方法34-36
• 2 結(jié)果36-45
• 2.1 CdtB蛋白的同源性分析36-37
• 2.2 陽性血清的制備37
• 2.3 蛋白包被濃度、血清稀釋度的確定37-38
• 2.4 封閉液的選擇38-39
• 2.5 封閉時(shí)間的確定39-40
• 2.6 血清稀釋液的選擇40
• 2.7 血清作用時(shí)間的確定40-41
• 2.8 二抗稀釋度的確定41-42
• 2.9 二抗作用時(shí)間的確定42
• 2.10 顯色時(shí)間的確定42-43
• 2.11 間接ELISA方法步驟的確定43
• 2.12 特異性實(shí)驗(yàn)43-44
• 2.13 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)44
• 2.14 間接ELISA方法的初步應(yīng)用44-45
• 3 討論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-47
• 第三章 CdtB和CdtC單克隆抗體的制備和初步應(yīng)用47-61
• 1 材料和方法47-51
• 1.1 材料47-48
• 1.2 方法48-51
• 2 結(jié)果51-58
• 2.1 間接ELISA檢測(cè)方法的建立51-52
• 2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立52
• 2.3 單抗亞類、上清和腹水效價(jià)的測(cè)定結(jié)果52-53
• 2.4 單抗Western-blot試驗(yàn)53-54
• 2.5 中和抗體的選擇54-55
• 2.6 基于CaCo-2細(xì)胞的黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)55-56
• 2.7 基于HD-11細(xì)胞的黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)56
• 2.8 HD-11細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的變化56-58
• 3 討論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文目錄61-62
• 致謝62-63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號(hào)：1038715