本文關(guān)鍵詞：結(jié)核亞單位疫苗EAMMB的構(gòu)建及表達(dá)純化

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【摘要】：目的：構(gòu)建不帶標(biāo)簽的結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白ESAT-6-Ag85B-MPT64(190-198)-MTB8.4-HBHA(31-199)(EAMMB)原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,獲得融合蛋白EAMMB,用于結(jié)核亞單位疫苗抗原篩選。 方法：以BCG基因組為模板,用PCR擴(kuò)增HBHA蛋白基因序列(含Sad和HindⅢ位點(diǎn)),并和本實(shí)驗(yàn)室已有的質(zhì)粒pET30a-EAMM同時(shí)進(jìn)行SacI和(?)indⅢ雙酶切,酶切后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET30a-EAMM連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-EAMMB,并通過DH5a大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒后,將質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌BL21(DE3)中。以誘導(dǎo)溫度37℃,誘導(dǎo)時(shí)間6h,誘導(dǎo)劑IPTG終濃度O.1mmol/L時(shí),最佳條件誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。并對(duì)表達(dá)蛋白的菌液,通過收集,破碎,離心,重懸菌體,洗滌等方法獲得粗純的蛋白,并用弱陰離子柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。 結(jié)果：獲得具有一定純度EAMMB蛋白,分子量預(yù)測(cè)在56000附近,經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳驗(yàn)證與預(yù)測(cè)值一致。 結(jié)論：融合蛋白EAMMB的成功表達(dá)及純化,為進(jìn)一步研究結(jié)核亞單位疫苗提供新的候選疫苗。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 亞單位疫苗 EAMMB HBHA
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• ~.略詞表8-9
• 前言9-12
• 1. 材料和方法12-27
• 1.1 材料12-16
• 1.1.1 材料12
• 1.1.2 儀器設(shè)備12-13
• 1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成13
• 1.1.4 主要試劑及配方13-16
• 1.2 方法16-27
• 1.2.1 技術(shù)路線16-17
• 1.2.2 BCG DNA基因組提取17
• 1.2.3 目的基因的擴(kuò)增17-18
• 1.2.4 質(zhì)粒提取18
• 1.2.5 質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物雙酶切鑒定及純化18-20
• 1.2.6 連接體系的建立20
• 1.2.7 轉(zhuǎn)化20-21
• 1.2.8 菌落PCR驗(yàn)證及雙酶切驗(yàn)證21
• 1.2.9 BL21(DE3)轉(zhuǎn)化21-22
• 1.2.10 蛋白表達(dá)及可溶性分析22-23
• 1.2.11 融合蛋白EAMMB純化23-25
• 1.2.12 蛋白HBHAd純化25
• 1.2.13 蛋白濃度測(cè)定25-27
• 2. 結(jié)果27-34
• 2.1 hbha基因的擴(kuò)增27
• 2.2 質(zhì)粒pET30a-EAMM提取和酶切27-28
• 2.3 質(zhì)粒pET30a-EAMMB雙酶切圖28
• 2.4 質(zhì)粒pET30a提取和酶切28
• 2.5 質(zhì)粒pET30a-HBHAd雙酶切圖28-29
• 2.6 測(cè)序結(jié)果圖29-30
• 2.7 融合蛋白EAMMB表達(dá)條件摸索30-31
• 2.8 融合蛋白EAMMB純化條件摸索31-32
• 2.8.1 洗滌次數(shù)的摸索31-32
• 2.8.2 硫酸銨沉淀?xiàng)l件摸索32
• 2.8.3 EAMMB純化結(jié)果32
• 2.9 帶His標(biāo)簽蛋白HBHAd純化32-34
• 2.9.1 咪唑洗脫濃度的摸索32-33
• 2.9.2 帶標(biāo)簽蛋白HBHAd純化結(jié)果33-34
• 3. 討論與結(jié)論34-36
• 3.1 討論34-35
• 3.2 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 綜述39-45
• 摘要39
• 1. 我國(guó)結(jié)核病現(xiàn)狀39
• 2. HBHA蛋白特性39-41
• 2.1 蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)39-40
• 2.2 分布特性40
• 2.3 免疫學(xué)特性40-41
• 3. HBHA在疫苗研制和結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展41
• 4. 展望41-43
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 在學(xué)期間研究成果45-46
• 致謝46

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Koussougbo Ouma Devi（烏瑪）;T-SPOT.TB在評(píng)估系統(tǒng)性自身免疫病合并結(jié)核病患者中的作用研究[D];中南大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1031461