本文關(guān)鍵詞：HMGB1在HTLV-1感染的T細(xì)胞中促進病毒復(fù)制的分子機制

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【摘要】：背景 三十年前,Poiese等從人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤患者的淋巴細(xì)胞中分離出來人類T細(xì)胞白血病1型病毒(Human T-cell Leukemia Virus Type1, HTLV-1), HTLV-1是人類歷史上第一個被發(fā)現(xiàn)的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒,它是引起成人T細(xì)胞白血病(Adult T-cell leukemia, ATL)的病原體,CD4+、CD8+T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是HTLV-1攻擊的主要靶細(xì)胞。目前全世界該病毒的攜帶者約1000萬～2000萬,大約有2%～5%的感染者發(fā)展為ATL,可以采用多種方法對ATL進行治療,但急性ATL的存活期平均不超過一年。盡管ATL的生存期很短,但從HTLV-1感染到發(fā)展為ATL需要大約20-40年的潛伏期。那么,在如此漫長的潛伏期中,HTLV-1與宿主的免疫系統(tǒng)是如何較量呢?尚不完全清楚,如果能真正闡明宿主細(xì)胞和HTLV-1之間的相互作用機制,就可以找到合適的靶點對HTLV-1感染者進行干預(yù),從而阻止ATL的發(fā)生。高遷移率組蛋白1(High Mobility Group Boxl, HMGB1)是一種高度保守的核蛋白,還是一種胞外損傷相關(guān)分子模式(Damage Associated Molecular Patterns, D AMPs),在細(xì)胞外具有細(xì)胞因子的功能,可以啟動天然和獲得性免疫過程,參與包括病毒在內(nèi)的病原體引起的感染和自身免疫等急慢性炎癥過程。近來人們發(fā)現(xiàn),HMGB1可以和Beclin-1(自噬關(guān)鍵蛋白之一)結(jié)合,參與細(xì)胞自噬(Autophagy)的調(diào)節(jié)。在之前的研究中,我們已經(jīng)證明HMGB1可以促進HTLV-1感染的T細(xì)胞中病毒的復(fù)制,但其促進HTLV-1復(fù)制的作用機制仍不明確。 目的 探討HMGB1對HTLV-1感染T細(xì)胞自噬的影響,研究HMGB1促進HTLV-1病毒復(fù)制的機制。研究HMGB1、HTLV-1病毒感染的細(xì)胞自噬和HTLV-1病毒復(fù)制三者之間的關(guān)系。方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)：MT2、HeLa細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有15%、10%滅活的胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、25mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基中,在含有5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次,調(diào)整細(xì)胞密度不超過1×106/mL； 2、質(zhì)粒構(gòu)建：pmCherry-LC3熒光質(zhì)粒,pHTLV-1-LTR-pEGF;以LC3-EGFP為模板擴增LC3全長,純化回收后,酶切4h,再次純化回收后,插入pmCherry-C1,挑取陽性克隆測序驗證。pHTLV-1-LTR-pEGF由美國Pittsburgh大學(xué)Xiao Gutian博士饋贈。 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用lipofectamine2000將pmCherry-LC3質(zhì)粒DNA和HTLV-1-LTR質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞,同時轉(zhuǎn)染各自的空載體質(zhì)粒DNA作為對照,4-6h后更換新的培養(yǎng)基并加入一定數(shù)量MT2(MT2:HeLa=1：2的數(shù)量比)細(xì)胞共培養(yǎng),12h后移除MT2細(xì)胞,加入新鮮培養(yǎng)基并加入相應(yīng)的藥物,作用36h后,共聚焦顯微鏡觀察HELA細(xì)胞感染HTLV-1病毒情況以及自噬關(guān)鍵蛋白LC3的表達(dá)及分布； 4、藥物處理：使用1μg/mLNaCl、1μg/mL重組人高遷移率組蛋白1(rhHMGB1)、3nM雷帕霉素(Rp,自噬誘導(dǎo)劑)、1μg/mL rhHMGB1+3nM Rp、5mM3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制劑)、5mM3-MA+1μg/mLrhHMGB1、200μM甘草酸(GA, HMGB1釋放抑制劑)、1μg/mL HMGB1抗體(HMGB1特異性中和劑)、1μg/mL IgG抗體(排除HMGB1抗體組的非特異性干擾)處理MT2和HeLa細(xì)胞,使用不同方法檢測相關(guān)分子的變化情況； 5、指標(biāo)檢測：在NaCl、rhHMGB1、Rp等藥物處理MT2細(xì)胞后,Western blot檢測p62、LC3、p19等蛋白的表達(dá)情況；電子顯微鏡觀察自噬泡；質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及NaCl、 rhHMGB1、Rp等藥物處理HeLa細(xì)胞后共聚焦顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞感染HTLV-1病毒情況以及自噬關(guān)鍵蛋白LC3的表達(dá)及分布情況； 6、統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析,實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析,兩組均數(shù)比較用t檢驗,p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1、成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-LC3; 2、電鏡結(jié)果：rhHMGB1處理MT2細(xì)胞后,與對照組相比,細(xì)胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量明顯增多,但是當(dāng)使用HMGB1釋放抑制劑GA和特異性中和抗體處理細(xì)胞之后,與rhHMGB1處理組相比,自噬小體的數(shù)量明顯下降； 3、Western blot結(jié)果：rhHMGB1處理MT2細(xì)胞之后,與對照組相比,p62蛋白水平下降,LC3-Ⅰ表達(dá)下降,LC3-Ⅱ表達(dá)升高,病毒蛋白Tax、p19表達(dá)水平升高；使用HMGB1釋放抑制劑GA和中和抗體處理細(xì)胞之后,p62蛋白水平升高,LC3-Ⅰ表達(dá)升高,LC3-Ⅱ表達(dá)下降,病毒蛋白Tax、p19表達(dá)水平下降。 4、共聚焦顯微鏡結(jié)果：rhHMGB1處理細(xì)胞之后,可見胞質(zhì)中LC3熒光顆粒明顯增多,并聚集成團塊狀。使用HMGB1釋放抑制劑GA和特異性中和抗體處理細(xì)胞之后,LC3呈點狀熒光顆粒散布于HeLa細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。 結(jié)論 HMGB1通過促進HTLV-1病毒感染細(xì)胞自噬,促進細(xì)胞內(nèi)HTLV-1病毒的復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：HTLV-1 HMGB1 自噬
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-14
• 實驗材料14-17
• 實驗方法17-28
• 實驗結(jié)果28-30
• 討論30-32
• 小結(jié)32-33
• 附圖33-36
• 參考文獻36-38
• 綜述：自噬及其與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒38-52
• 參考文獻47-52
• 英文縮寫詞52-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況53-54
• 致謝54-55
• 個人簡歷55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1031185