本文關(guān)鍵詞：miR-16在M2型巨噬細(xì)胞選擇性激活中的作用研究

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【摘要】：目的： 我們課題組前期研究應(yīng)用microRNA芯片技術(shù)篩選出肝癌組織差異表達(dá)microRNAs,發(fā)現(xiàn)miR-16在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)。初步預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-16在單核細(xì)胞中高表達(dá),而在體外誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞中miR-16表達(dá)下調(diào),提示miR-16的下調(diào)可能與巨噬細(xì)胞向M2型分化有關(guān)。本項(xiàng)目進(jìn)一步探索miR-16對M2型巨噬細(xì)胞分化的調(diào)控作用,明確調(diào)節(jié)miR-16表達(dá)水平升高對巨噬細(xì)胞表型和功能分化的影響。本研究將揭示調(diào)控巨噬細(xì)胞分化的關(guān)鍵microRNA分子,為阻斷巨噬細(xì)胞向M2型激活提供潛在干預(yù)靶點(diǎn),也為調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫提供新的思路。 方法： 1.為了明確miR-16在M2型巨噬細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化,將45ng/ml的IL-4加入人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(THP-1),使其分化為M2型巨噬細(xì)胞,用ELISA法檢測巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)前后IL-10的分泌情況,用Real-time PCR法檢測巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)前后miR-16的表達(dá)情況。 2.建立miR-16過表達(dá)細(xì)胞株：首先構(gòu)建miR-16過表達(dá)慢病毒載體；其次選用THP-1細(xì)胞系,將其體外誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞,加入輔助感染試齊polybreen以及LV-hsa-mir-16-1病毒,培養(yǎng)48小時(shí)以后觀察細(xì)胞狀態(tài),并更換為新鮮培養(yǎng)基,加入嘌呤霉素(Puromycin)篩選,以提高感染效率。感染3-4天后,觀察熒光表達(dá)情況。感染5天后,進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)；用流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR法等分別檢測感染效率,評價(jià)miR-16的過表達(dá)情況。 3.為了明確調(diào)節(jié)miR-16表達(dá)水平升高對巨噬細(xì)胞表型和功能分化的影響：用PI染色檢測過表達(dá)miR-16對M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；用ELISA法檢測M2型巨噬細(xì)胞miR-16過表達(dá)組和對照組上清液中IL-10的分泌情況；用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)組和對照組胞內(nèi)IL-10的表達(dá)情況；用Western blot法檢測過表達(dá)組和對照組精氨酸蛋白酶-1(arginase-1, Argl)的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.THP-1細(xì)胞系經(jīng)IL-4誘導(dǎo)后,上清中IL-10的分泌逐漸增加,誘導(dǎo)至6-7d達(dá)峰值,提示M2型巨噬細(xì)胞體外誘導(dǎo)成功。檢測誘導(dǎo)前后miR-16的相對表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：IL-4激活單核細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞后,miR-16表達(dá)下調(diào)。 2.M2型巨噬細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染,嘌呤霉素篩選后,流式細(xì)胞儀檢測GFP表達(dá)率提高至97.7%。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：過表達(dá)組中miR-16基因的表達(dá)水平可以達(dá)到陰性對照組的7.644±0.110倍(P0.05)。 3.M2型巨噬細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染過表達(dá)miR-16后,對照組在G1/G0期細(xì)胞的比例為54.67%,而過表達(dá)組在G1/G0比例則增至62.25%；過表達(dá)組在S期細(xì)胞的比例為36.31%,低于對照組在S期細(xì)胞的比例(42.12%),提示：miR-16引起細(xì)胞周期G1期阻滯(P值0.05)。 4. ELISA法檢測M2型巨噬細(xì)胞miR-16過表達(dá)組上清液中IL-10的分泌量為72.15±0.158pg/ml,較對照組(103.47±0.136pg/ml)低(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測M2型巨噬細(xì)胞過表達(dá)組和對照組IL-10胞內(nèi)染色差異顯示：過表達(dá)組IL-10的平均熒光強(qiáng)度Gm為3.47,胞內(nèi)IL-10的表達(dá)水平較對照組(Gm=12.40)低(P0.05)。Western blot法檢測M2型巨噬細(xì)胞精氨酸蛋白酶-1(arginase-1, Argl)的表達(dá)情況,各組Argl表達(dá)相對值即Argl/β-actin的灰度值比值分別為：陰性對照組0.4565±3.14%,過表達(dá)組0.1158±2.83%。陰性對照和過表達(dá)組之間Arg1表達(dá)相對值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： IL-4激活單核細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞后,miR-16表達(dá)下調(diào)。通過慢病毒感染,過表達(dá)miR-16后,M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞周期G1期阻滯,上清和胞內(nèi)IL-10的分泌均下調(diào),Argl蛋白表達(dá)水平同時(shí)下調(diào),提示miR-16影響M2型巨噬細(xì)胞的表型和功能,對M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生了一定程度的重塑作用。
【關(guān)鍵詞】：M2型巨噬細(xì)胞 miR-16 白介素-10 精氨酸蛋白酶-1
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-7
• 目錄7-8
• 符號說明8-10
• 前言10-15
• 材料與試劑15-18
• 方法與步驟18-31
• 結(jié)果31-39
• 討論39-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 綜述48-54
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 致謝54-55
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄55-56

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭秋均;李杰;;腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在重塑腫瘤免疫微環(huán)境中的作用[J];腫瘤;2013年10期

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本文編號：1029571