本文關(guān)鍵詞：維生素D受體在幽門螺桿菌感染中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景： 維生素D是一種具有廣泛生物效應(yīng)的激素載體,它除了有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝,調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育等作用之外,同時(shí)也與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。其功能主要是通過維生素D3受體(Vitamin D receptor,VDR)來介導(dǎo),VDR為親核蛋白,屬于類固醇激素／甲狀腺受體超家族的成員。VDR與1,25(OH)2D3結(jié)合形成VDR/RXR,該復(fù)合物可與靶基因上游啟動(dòng)子區(qū)或調(diào)控區(qū)域上的特定DNA序列相結(jié)合,進(jìn)而對靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。 VDR參與鈣離子代謝、骨骼形成、細(xì)胞生長分化、腫瘤抑制、免疫調(diào)節(jié)等各個(gè)環(huán)節(jié),與病原微生物感染密切相關(guān)的靶基因cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP)的活化具有密切的相關(guān)性。CAMP除了具有抗菌活性外,還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制組織損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)等功能,是宿主防御系統(tǒng)的重要成分。 作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,VDR是否對H. pylori感染具有免疫保護(hù)作用目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。目前認(rèn)為VDR在抗感染免疫中起重要作用,可能與清除微生物感染和減輕組織損傷相關(guān)。進(jìn)一步研究VDR對細(xì)菌感染的免疫保護(hù)效果及其誘導(dǎo)的炎癥和免疫信號通路在抗感染過程中的作用具有重要意義。 方法： 1)收集門診病人胃黏膜標(biāo)本：胃鏡下活檢胃黏膜標(biāo)本兩份,一份送病理,一份液氮保存。 2) H. pylori感染胃黏膜上皮細(xì)胞：胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1鋪板培養(yǎng)24h之后,以不同的MOI值(MOI=0,10,50,100)與H. pylori共培養(yǎng)24h或以MOI值為100分別共培養(yǎng)0h,6h,12h,24h。 3) siVDR轉(zhuǎn)染胃黏膜上皮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天,在不包含抗生素的RPMI培養(yǎng)基中接種細(xì)胞,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度要達(dá)到30～50%。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將雙鏈siRNA導(dǎo)入到GES-1細(xì)胞。設(shè)立陰性對照組(轉(zhuǎn)染無敲低效果的VDR-negative siRNA),實(shí)驗(yàn)組(分別轉(zhuǎn)染3對VDR siRNA)。 4) RT-qPCR檢測：抽提組織或細(xì)胞Total RNA,檢測RNA濃度和純度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用SYBR Green定量PCR試劑檢測VDR、CAMP、IL-6、 IL-8、CYP24A、DEFB4mRNA的表達(dá)情況,以GAPDH作為內(nèi)參分析基因表達(dá)水平。 5)Western-Blot檢測：采用Lysis buffer抽提蛋白,應(yīng)用Bradford法檢測蛋白濃度,蛋白變性后上樣至泳道進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉1h,一抗4℃孵育過夜,再用HRP標(biāo)記的二抗孵育1h,ECL化學(xué)發(fā)光后顯影、定影,最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。 6) ELISA檢測：吸取12孔培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基,5000g/min離心后,獲得的上清液按照一定比例稀釋,按照試劑說明書檢測梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本炎癥因子的濃度。 7)細(xì)菌活力檢測：GES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siVDR、siCAMP或1,25(OH)2D3干預(yù)48h,然后加MOI為100的H. pylori共培養(yǎng)2h,將細(xì)胞裂解倍比稀釋,以500ul稀釋液劃線涂板,培養(yǎng)3-5天后菌落計(jì)數(shù)。 8)統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行資料的t檢驗(yàn)、方差分析以及Person's相關(guān)分析,P0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1)組織水平H. pylori感染對mRNA表達(dá)水平的影響：H. pylori感染組與正常對照組比較VDR、CAMP、IL-6、IL-8均表達(dá)上調(diào),VDR mRNA水平與慢性炎癥程度呈正相關(guān)的關(guān)系(r=0.536,P0.001),CAMP與VDR mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.814,P0.001)。 2)細(xì)胞感染H. pylori對VDR、CAMP表達(dá)的影響：RT-qPCR及Western-Blot結(jié)果顯示H. pylori感染組與對照組相比VDR、CAMP表達(dá)水平升高,并且具有時(shí)間和MOI值依賴性。 3)敲低VDR基因?qū)ο掠位駽AMP以及炎癥因子的影響：VDR敲低之后,下游基因CAMP表達(dá)水平下調(diào),DEFB4以及CYP24A1表達(dá)下調(diào),炎癥因子IL-6、IL-8升高。 4) VDR激動(dòng)劑1,25(OH)2D3在H. pylori感染中的作用：1,25(OH)2D3導(dǎo)致GES-1細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-8表達(dá)下調(diào),抗菌肽CAMP.防御素DEFB4、CYP24A1表達(dá)升高。 5) siVDR、siCAMP以及1,25(OH)2D3對H. pylori活力的影響：siVDR、siCAMP使GES-1抗菌活力下降,細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)量增加,而1,25(OH)2D3降低活菌數(shù)量。 結(jié)論： 1)組織、細(xì)胞水平驗(yàn)證H. pylori感染導(dǎo)致VDR、CAMP、IL-6、IL-8表達(dá)上調(diào)； 2)VDR聯(lián)合激動(dòng)劑1,25(OH)2D3具有調(diào)控下游基因抗菌肽CAMP、防御素DEFB4及CYP24A1的作用；VDR聯(lián)合激動(dòng)劑1,25(OH)2D3具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 維生素D受體 活性維生素D_3 抗菌肽
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 縮略語13-14
• 目次14-15
• 1 引言15-18
• 2 材料與方法18-29
• 3 結(jié)果29-40
• 4 討論40-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 綜述49-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 附錄60-63
• 作者簡歷63

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本文編號：1018989