發(fā)布時間：2017-10-12 13:29

  本文關(guān)鍵詞：維生素D受體在幽門螺桿菌感染中的作用及機制研究

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【摘要】：研究背景： 維生素D是一種具有廣泛生物效應的激素載體,它除了有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝,調(diào)控細胞生長發(fā)育等作用之外,同時也與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。其功能主要是通過維生素D3受體(Vitamin D receptor,VDR)來介導,VDR為親核蛋白,屬于類固醇激素／甲狀腺受體超家族的成員。VDR與1,25(OH)2D3結(jié)合形成VDR/RXR,該復合物可與靶基因上游啟動子區(qū)或調(diào)控區(qū)域上的特定DNA序列相結(jié)合,進而對靶基因的轉(zhuǎn)錄表達進行調(diào)控。 VDR參與鈣離子代謝、骨骼形成、細胞生長分化、腫瘤抑制、免疫調(diào)節(jié)等各個環(huán)節(jié),與病原微生物感染密切相關(guān)的靶基因cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP)的活化具有密切的相關(guān)性。CAMP除了具有抗菌活性外,還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制組織損傷、促進創(chuàng)傷修復等功能,是宿主防御系統(tǒng)的重要成分。 作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,VDR是否對H. pylori感染具有免疫保護作用目前尚未見文獻報道。目前認為VDR在抗感染免疫中起重要作用,可能與清除微生物感染和減輕組織損傷相關(guān)。進一步研究VDR對細菌感染的免疫保護效果及其誘導的炎癥和免疫信號通路在抗感染過程中的作用具有重要意義。 方法： 1)收集門診病人胃黏膜標本：胃鏡下活檢胃黏膜標本兩份,一份送病理,一份液氮保存。 2) H. pylori感染胃黏膜上皮細胞：胃黏膜上皮細胞GES-1鋪板培養(yǎng)24h之后,以不同的MOI值(MOI=0,10,50,100)與H. pylori共培養(yǎng)24h或以MOI值為100分別共培養(yǎng)0h,6h,12h,24h。 3) siVDR轉(zhuǎn)染胃黏膜上皮細胞：轉(zhuǎn)染前一天,在不包含抗生素的RPMI培養(yǎng)基中接種細胞,轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度要達到30～50%。應用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將雙鏈siRNA導入到GES-1細胞。設立陰性對照組(轉(zhuǎn)染無敲低效果的VDR-negative siRNA),實驗組(分別轉(zhuǎn)染3對VDR siRNA)。 4) RT-qPCR檢測：抽提組織或細胞Total RNA,檢測RNA濃度和純度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用SYBR Green定量PCR試劑檢測VDR、CAMP、IL-6、 IL-8、CYP24A、DEFB4mRNA的表達情況,以GAPDH作為內(nèi)參分析基因表達水平。 5)Western-Blot檢測：采用Lysis buffer抽提蛋白,應用Bradford法檢測蛋白濃度,蛋白變性后上樣至泳道進行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉1h,一抗4℃孵育過夜,再用HRP標記的二抗孵育1h,ECL化學發(fā)光后顯影、定影,最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。 6) ELISA檢測：吸取12孔培養(yǎng)板上的培養(yǎng)基,5000g/min離心后,獲得的上清液按照一定比例稀釋,按照試劑說明書檢測梯度稀釋的標準品以及樣本炎癥因子的濃度。 7)細菌活力檢測：GES-1細胞轉(zhuǎn)染siVDR、siCAMP或1,25(OH)2D3干預48h,然后加MOI為100的H. pylori共培養(yǎng)2h,將細胞裂解倍比稀釋,以500ul稀釋液劃線涂板,培養(yǎng)3-5天后菌落計數(shù)。 8)統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)統(tǒng)計均用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行資料的t檢驗、方差分析以及Person's相關(guān)分析,P0.05表示差別具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1)組織水平H. pylori感染對mRNA表達水平的影響：H. pylori感染組與正常對照組比較VDR、CAMP、IL-6、IL-8均表達上調(diào),VDR mRNA水平與慢性炎癥程度呈正相關(guān)的關(guān)系(r=0.536,P0.001),CAMP與VDR mRNA表達水平呈正相關(guān)(r=0.814,P0.001)。 2)細胞感染H. pylori對VDR、CAMP表達的影響：RT-qPCR及Western-Blot結(jié)果顯示H. pylori感染組與對照組相比VDR、CAMP表達水平升高,并且具有時間和MOI值依賴性。 3)敲低VDR基因?qū)ο掠位駽AMP以及炎癥因子的影響：VDR敲低之后,下游基因CAMP表達水平下調(diào),DEFB4以及CYP24A1表達下調(diào),炎癥因子IL-6、IL-8升高。 4) VDR激動劑1,25(OH)2D3在H. pylori感染中的作用：1,25(OH)2D3導致GES-1細胞炎癥因子IL-6、IL-8表達下調(diào),抗菌肽CAMP.防御素DEFB4、CYP24A1表達升高。 5) siVDR、siCAMP以及1,25(OH)2D3對H. pylori活力的影響：siVDR、siCAMP使GES-1抗菌活力下降,細胞內(nèi)活菌數(shù)量增加,而1,25(OH)2D3降低活菌數(shù)量。 結(jié)論： 1)組織、細胞水平驗證H. pylori感染導致VDR、CAMP、IL-6、IL-8表達上調(diào)； 2)VDR聯(lián)合激動劑1,25(OH)2D3具有調(diào)控下游基因抗菌肽CAMP、防御素DEFB4及CYP24A1的作用；VDR聯(lián)合激動劑1,25(OH)2D3具有調(diào)節(jié)免疫反應的作用。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 維生素D受體 活性維生素D_3 抗菌肽
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 縮略語13-14
• 目次14-15
• 1 引言15-18
• 2 材料與方法18-29
• 3 結(jié)果29-40
• 4 討論40-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-49
• 綜述49-60
• 參考文獻56-60
• 附錄60-63
• 作者簡歷63

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1 程謨斌,鄧博雅,張真榕,李巍,趙東,劉清利,丁梅,王保捷;中國4個群體VDR基因2號外顯子的SNP基因座遺傳多態(tài)性[J];中國法醫(yī)學雜志;2002年04期

2 高玉婧;裴秀英;楊華;劉芳;蔣學峰;;維生素D受體基因多態(tài)性與寧夏結(jié)核病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究[J];寧夏醫(yī)學雜志;2008年08期

3 沙繼斌;田澤君;趙士富;;抗菌肽的內(nèi)源性表達調(diào)控研究進展[J];現(xiàn)代免疫學;2007年03期

4 常偉;周岐新;楊俊霞;;Ber對肝HepG2細胞Insig-2和VDR基因表達的影響[J];中成藥;2008年07期

5 帥波;沈霖;郭向飛;楊艷萍;謝晶;周丕琪;曹晴晴;魏兵;;密骨膠囊對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)25(OH)D_3和1,25(OH)_2D_3含量及腎臟VDR mRNA表達的影響[J];中西醫(yī)結(jié)合研究;2009年04期

6 張軍,梁曉萍,戴勇,文錦麗,周文英,周雅穎;密蓋息對骨質(zhì)疏松大鼠治療作用的實驗研究[J];頸腰痛雜志;2004年03期

7 張衛(wèi)民,周殿元;抗菌肽與幽門螺桿菌感染[J];生命的化學;2003年01期

8 張衛(wèi)民,賴卓勝,周殿元;幽門螺桿菌感染者的生存競爭優(yōu)勢[J];世界華人消化雜志;2004年06期

9 姜葵;王邦茂;王天雄;;抗菌肽、防御素與消化系統(tǒng)疾病[J];醫(yī)學綜述;2006年11期

10 余曉丹,顏崇淮,沈曉明;缺鋅對大鼠小腸粘膜維生素D受體及鈣結(jié)合蛋白基因表達的影響[J];營養(yǎng)學報;2005年03期

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1 邊鋼;;VDR系統(tǒng)主控制器的研究設計[A];中國通信學會第五屆學術(shù)年會論文集[C];2008年

2 王勝正;關(guān)克平;;基于VDR與虛擬現(xiàn)實技術(shù)的海事分析系統(tǒng)的研究[A];中國航海學會通信導航專業(yè)委員會2005年學術(shù)年會論文集[C];2005年

3 沈霖;郭向飛;武嘉林;帥波;;阿膠強骨口服液對去卵巢大鼠25－OH－VD3、1,25－(OH)2－VD3及VDR mRNA的影響[A];中華中醫(yī)藥學會骨傷分會第四屆第三次學術(shù)年會暨國家中醫(yī)藥管理局“十一五”重點專科（專�。┙ㄔO骨傷協(xié)作組經(jīng)驗交流會論文匯編[C];2008年

4 秦銳;羅楠;郭錫熔;劉昔榮;;膳食鈣干預對肥胖大鼠鈣調(diào)激素及脂肪組織VDR、FAS基因表達的影響[A];第六屆全國優(yōu)生科學大會論文匯編[C];2006年

5 毛奇凰;王衛(wèi)寧;施朝鍵;王巖;;AIS及其應用[A];中國航海學會通信導航專業(yè)委員會2005年學術(shù)年會論文集[C];2005年

6 王靜;祝平;;抗菌肽在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應用研究進展[A];2008山東飼料科學技術(shù)交流大會論文集[C];2008年

7 梁延彬;;抗菌肽在養(yǎng)豬業(yè)中的應用進展[A];2011豬免疫抑制病防控與營養(yǎng)保健技術(shù)專題論壇會刊[C];2011年

8 明雙喜;王沂蒙;劉艷;江國托;;抗菌肽作用機理及其在生產(chǎn)方面的研究進展[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應用技術(shù)研討會論文集[C];2009年

9 陸婕;鐘雅;柳林;付康;陳正望;;家蠅蛆抗菌肽提取工藝研究[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應用技術(shù)研討會論文集[C];2009年

10 張東玲;黃文樹;粱英;關(guān)瑞章;宋凱;;日本鰻鱺肝臟抗菌肽的分離純化[A];“細胞活動 生命活力”——中國細胞生物學學會全體會員代表大會暨第十二次學術(shù)大會論文摘要集[C];2011年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 本報記者 顧捷;船舶要裝“黑匣子”[N];中國遠洋報;2001年

2 王海燕;廠商攜手齊推VDR[N];中國質(zhì)量報;2000年

3 紅梅;船舶須裝“黑匣子”[N];國際經(jīng)貿(mào)消息;2000年

4 本報記者 王寶鈞;VDR消費熱潮嗎？[N];中國電子報;2000年

5 《金周刊》記者 譚琴;推出“船用黑匣子” 安可爾駛?cè)?20億市場[N];中國經(jīng)營報;2001年

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7 鄭君;對航行安全要求更高[N];中國船舶報;2002年

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9 本報記者章軻;重操舊業(yè) 廈新苦尋“第二春”[N];中國經(jīng)營報;2002年

10 ;家庭數(shù)字視頻存儲之道[N];中國計算機報;2001年

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1 鄭敏;急性白血病兒童維生素D受體基因多態(tài)性和表達及維生素D對白血病細胞的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2011年

2 崔健;IGFBP-6與VDR的相互作用與功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

3 裴鳳華;VDR基因多態(tài)性和hBD與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系[D];吉林大學;2011年

4 米洋;HR對核受體VDR靶基因調(diào)控機制的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2010年

5 彭峰;核受體VDR在高糖誘導人血管內(nèi)皮細胞氧化應激中的作用及機制[D];福建醫(yī)科大學;2013年

6 周文君;艦船VDR人聲識別技術(shù)研究[D];哈爾濱工程大學;2009年

7 侯素春;維A酸和涼血活血復方及黃芪注射液治療銀屑病的臨床及實驗研究[D];大連醫(yī)科大學;2008年

8 席啟林;維生素D受體調(diào)控尿鈣重吸收的分子機制研究[D];華中科技大學;2010年

9 王漢洲;SGT促凋亡作用及Cyclin D3與VDR相互作用對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響研究[D];復旦大學;2005年

10 李攀;維生素D與炎癥性腸病臨床特征的相關(guān)性研究及其作用通路中炎性因子的遺傳易感性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

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1 郭利華;維生素D受體在幽門螺桿菌感染中的作用及機制研究[D];浙江大學;2013年

2 吳江東;NRAMP1基因、VDR基因多態(tài)性與新疆漢族結(jié)核病相關(guān)性研究[D];石河子大學;2009年

3 高遠;中國部分黃牛VDR基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[D];西北農(nóng)林科技大學;2012年

4 田麗花;25（OH）D3、VDR與糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松關(guān)系的實驗研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

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