本文關(guān)鍵詞：口服GLP-1類似肽轉(zhuǎn)化雙歧桿菌治療2型糖尿病模型小鼠療效觀察

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【摘要】：糖尿病是嚴重影響人類身體健康的重大疾病之一。2型糖尿病是最主要的糖尿病類型,占患病總數(shù)的90%以上。2型糖尿病的發(fā)病與生活水平和飲食結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。高脂飲食和肥胖是誘發(fā)2型糖尿病的主要因素。近三十多年來,由于我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人民生活水平的提高,2型糖尿病的發(fā)病率迅速攀升,患病率從不到1%,到現(xiàn)在超高10%,患病人數(shù)已超過1億。糖尿病可引起心腦血管疾病、腎功能衰竭、周圍神經(jīng)病變及眼底病變等多種并發(fā)癥。糖尿病的防治成為當(dāng)今醫(yī)藥領(lǐng)域最為關(guān)注的熱點之一。 2型糖尿病的突出表現(xiàn)是胰島素抵抗,血糖進行性升高和糖耐量下降�，F(xiàn)有的降糖藥物雖然有一定的降糖或改善胰島素抵抗的療效,但是都無法恢復(fù)胰島p細胞功能。即使接受系統(tǒng)、持續(xù)的治療,胰島功能也總是在不斷地衰退。因此,這些降糖藥物都只能延緩病情進展,無法徹底修復(fù)胰島功能,使病情得到有效控制。 胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide1, GLP-1)是一種由腸上皮L細胞分泌的短肽激素,屬于腸促胰素的一種�，F(xiàn)已證明GLP-1具有刺激胰島p細胞增殖和胰島素分泌,抑制β細胞凋亡,提高肌肉、肝臟細胞對胰島素的敏感性。另外,它還可以通過調(diào)控食欲、抑制能量吸收和動員脂肪等多方面的作用來降低血糖和改善胰島素抵抗。GLP-1類似肽——利拉魯肽(liraglutide)和艾塞那肽(exenatide或extendin-4, EX4)現(xiàn)已成為肥胖和糖尿病防治的新藥。但是,目前GLP-1類似肽都是采用化學(xué)合成方法進行生產(chǎn),離不開多肽的分離純化工藝,只能注射途徑給藥,不能口服,存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高和使用不便的缺點。迫切地需要改進GLP-1類似肽的生產(chǎn)和給藥方式,降低藥物副作用。 雙歧桿菌是哺乳動物體內(nèi)最安全、最有益于身體健康的益生菌群之一,是人體腸道的第一批居民,是嬰幼兒腸道中主要菌群。雙歧桿菌不僅具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境、抑制致病菌生長,促進營養(yǎng)吸收的作用,而且還具有免疫調(diào)理、分解有毒的代謝中間產(chǎn)物和預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用。雙歧桿菌作為食品、藥品已經(jīng)有幾百年的歷史,其安全性也得到充分驗證。以雙歧桿菌為宿主菌來表達功能多肽是最安全、最簡便的途徑,有利于長期用藥。因此,我們利用雙歧桿菌來表達GLP-1類似肽,并探討其降血糖和改善胰島素抵抗的療效。 在已建立的雙歧桿菌表達系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了GLP-1改構(gòu)肽GLP-1(8G)和類似肽EX4雙歧桿菌表達載體,轉(zhuǎn)化獲得,攜帶有GLP-1(8G)和EX4基因的轉(zhuǎn)化雙歧桿菌。體外分析雙歧桿菌表達的GLP-1(8G)和EX4的表達表達規(guī)律及生物學(xué)活性；體內(nèi)對高脂高糖飲食和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病模型小鼠的治療實驗觀測其降糖的療效,并探討其分子作用機制。具體的實驗設(shè)計方案如下：(1)選擇以往實驗已構(gòu)建好的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒載體pBBADs-EV與化學(xué)合成的GLP-1改構(gòu)肽GLP-1(8G)和類似肽EX4基因片段,構(gòu)建并測序鑒定pBBADs-GLP-1(8G)與pBBADs-EX4穿梭質(zhì)粒,將pBBADs-GLP-1(8G)與pBBADs-EX4質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到長雙歧桿菌(NCC2705)中,厭氧培養(yǎng)48h后,篩選出陽性克隆菌落。GLP-1(8G)轉(zhuǎn)化雙歧桿菌命名為BL-GLP-1(8G); EX4轉(zhuǎn)化雙歧桿菌命名為BL-EX4;空載體pBBADs-EV轉(zhuǎn)化雙歧桿菌命名為BL-EV。把轉(zhuǎn)化雙歧桿菌接種到含有氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基當(dāng)中,以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)表達12h、24h、36h后,分別用ELISA和Western blot法驗證轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌中的GLP-1(8G)與EX4蛋白表達水平,并選擇最佳的誘導(dǎo)表達時間。(2)在生長狀態(tài)良好的INS-1細胞(ratinsulinoma cell)中加入含有BL-GLP-1(8G)與BL-EX4誘導(dǎo)表達后的培養(yǎng)上清,用CCK-8細胞毒性試劑盒進行細胞毒性檢測。(3) BL-GLP-1(8G)與BL-EX4分泌蛋白的體外生物學(xué)活性試驗：將轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)培養(yǎng)的上清培養(yǎng)INS-1細胞24h,48h后,運用ELISA測定培養(yǎng)液中胰島素含量的變化情況。(4) BL-GLP-1(8G)與BL-EX4分泌蛋白的模型動物治療功能性試驗：運用高脂高糖喂食C57BL/6J小鼠后,腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ),成功造成2型糖尿病模型后,分組后給予小鼠灌胃0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)表達后的BL-GLP-1(8G)與BL-EX4連續(xù)治療28天,以BL-EV組為陽性對照。①2型糖尿病小鼠的造模與判定：用高糖高脂飼料飼養(yǎng)小鼠48天后,以10mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)的劑量腹腔注射,禁食12h后,剪鼠尾取血,使用血糖儀測定血糖,并達到了糖尿病小鼠非空腹血糖的成膜標(biāo)準(zhǔn)(11.1mmol/L)者被初步判定為2型糖尿病小鼠,并繼續(xù)高脂高糖喂食；②灌胃0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)表達后的BL-GLP-1(8G)與BL-EX4連續(xù)治療28天,摘眼球取血,2000rpm低溫離心10min,取血漿保存于4℃冰箱,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)等生化指標(biāo)采用全自動生化檢測儀進行檢測；③處理小鼠時,取各組新鮮的肝組織,迅速放入液氮。從液氮中取出的肝組織,剪取各組組織100mg左右,放入研磨皿中研磨,加入Triol提取組織中的RNA,立即逆轉(zhuǎn)錄成DNA,運用熒光定量PCR的方法檢測Adiponectin (脂聯(lián)素)、Adiponectin acceptor(脂聯(lián)素受體)和Resistin (抵抗素)在肝組織中的表達水平；油紅O染色法分析脂肪肝病變程度；④各取一部分肝臟組織,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,進行HE染色對其肝組織的形態(tài)進行分析；⑤取各組胰島部分,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切成10μm后,進行免疫組化分析其經(jīng)過治療后的p胰島的形態(tài)與分泌情況變化。(5)驗證GLP-1受體在小鼠結(jié)腸與INS-1細胞中存在：①剪取正常小鼠部分結(jié)腸,超聲裂解,低溫離心,取上清貯存在-20℃?zhèn)溆?運用Western blot方法鑒定；②用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細胞48h后,超聲裂解后,低溫離心,運用Western blot方法鑒定；③剪取正常小鼠部分結(jié)腸,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,進行免疫組化處理鑒定；④取正常小鼠部分結(jié)腸,常規(guī)石蠟包埋,切成10μm后,按組織免疫熒光方法處理,封片后,運用共聚照顯微鏡(confocal圖像)405/488nm波長下拍照鑒定；⑤在6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)到狀態(tài)良好時,按照細胞免疫熒光方法處理,運用共聚照顯微鏡(confocal圖像)在405/488nm波長下拍照鑒定； 研究結(jié)果顯示：(1)在長雙歧桿菌(NCC2705)中,成功構(gòu)建了能夠分泌GLP-1改構(gòu)肽GLP-1(8G)和類似肽EX4的雙歧桿菌BL-GLP-1(8G)與BL-EX4傳遞體；經(jīng)過挑選鑒定的BL-GLP-1(8G)和BL-EX4轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌在生物與形態(tài)學(xué)上并沒有顯著的改變。經(jīng)過L-阿拉伯糖體外誘導(dǎo)后,其分泌的蛋白,能夠在轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌的上清與菌體中檢測出來,測定最佳的誘導(dǎo)表達式時間是24h。(2) BL-GLP-1(8G)與BL-EX4經(jīng)過0.2%L-Ara誘導(dǎo)表達后的培養(yǎng)上清對INS-1細胞有增殖作用,且ELISA檢測其細胞培養(yǎng)上清,證明其誘導(dǎo)后的培養(yǎng)上清胰島素的量顯著升高。(3)空腹血糖、口服葡萄糖糖耐量實驗中,經(jīng)過灌胃BL-GLP-1(8G)和BL-EX4的T2DM的小鼠,相對灌胃BL-EV的T2DM小鼠來說有顯著效果(P0.05)。(4)對于血漿的生化檢測,與BL-EV組相比,灌胃BL-GLP-1(8G)治療的小鼠的VLDL、TG、LDL都有顯著的變化。(5)與BL-EV組相比,經(jīng)過灌胃BL-GLP-1(8G)和BL-EX4治療28天后,ELISA法證明血清中的Adiponectin(脂聯(lián)素)水平有顯著性升高。(6)運用Western blot,共聚照顯微鏡(confocal)與免疫組化的方法,證明INS-1細胞與C57BL/6J小鼠結(jié)腸上確實存在相同的GLP-1R受體。 總之,我們成功構(gòu)建了攜帶有GLP-1(8G)和EX4的雙歧桿菌表達載體,并篩選獲得目的基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌；在基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的菌體與培養(yǎng)上清能夠檢測到GLP-1(8G)和EX4的表達；體外實驗證明轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的GLP-1(8G)和EX4表達產(chǎn)物能促進INS-1細胞增殖,并刺激胰島素分泌；體內(nèi)對高脂高糖飲食和STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型小鼠的治療實驗證實,口服GLP-1(8G)和EX4轉(zhuǎn)化雙歧桿菌可以觀測其降糖的療效,并探討其分子作用機制。 相對于目前在市面上的GLP-1類似物注射劑,轉(zhuǎn)基因BL-GLP-1(8G)口BL-EX4具備了體內(nèi)誘導(dǎo)表達,經(jīng)腸上受體直接吸收,減少腎毒性的發(fā)生；生產(chǎn)工藝簡單,不需任何提取純化即可服用,降低了生產(chǎn)純化成本,提高社會效益；只需通過口服等方式,簡便、無毒、無痛,可以明顯地降低疼痛感,增強其適應(yīng)性；在體內(nèi)誘導(dǎo)表達,降低其半衰期短的缺點,可不問斷發(fā)揮作用,治療效果顯著。結(jié)合動物實驗的療效結(jié)果來看,可預(yù)想到未來可對人類的2型糖尿病的治療,具有十分具大的發(fā)展?jié)摿�。因�?BL-GLP-1(8G)與BL-EX4有望成為擁有GLP-1類似物對糖尿病的治療作用的一種新劑型,并且能夠調(diào)節(jié)病人腸道微生物的新一代益生菌。
【關(guān)鍵詞】：T2DM 長雙歧桿菌 GLP-1 改構(gòu)肽 GLP-1(8G)和類似肽 EX4 轉(zhuǎn)化雙歧桿菌 GLP-1R受體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R587.1;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-32
• 實驗方法32-47
• 結(jié)果47-64
• 討論64-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻71-79
• 攻讀學(xué)位期間參與發(fā)表的文章79-80
• 英文縮略詞表80-82
• 附圖82-91
• 致謝91-92

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 何明清,謝鏡懷,朱玉蘭,張明偉,康白;病、健仔豬不同腸段菌群的研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報;1986年04期

2 中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組;非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)[J];中華肝臟病雜志;2003年02期

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本文編號：1013233