本文關(guān)鍵詞：口服GLP-1類似肽轉(zhuǎn)化雙歧桿菌治療2型糖尿病模型小鼠療效觀察

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【摘要】：糖尿病是嚴(yán)重影響人類身體健康的重大疾病之一。2型糖尿病是最主要的糖尿病類型,占患病總數(shù)的90%以上。2型糖尿病的發(fā)病與生活水平和飲食結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。高脂飲食和肥胖是誘發(fā)2型糖尿病的主要因素。近三十多年來,由于我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的提高,2型糖尿病的發(fā)病率迅速攀升,患病率從不到1%,到現(xiàn)在超高10%,患病人數(shù)已超過1億。糖尿病可引起心腦血管疾病、腎功能衰竭、周圍神經(jīng)病變及眼底病變等多種并發(fā)癥。糖尿病的防治成為當(dāng)今醫(yī)藥領(lǐng)域最為關(guān)注的熱點(diǎn)之一。 2型糖尿病的突出表現(xiàn)是胰島素抵抗,血糖進(jìn)行性升高和糖耐量下降�，F(xiàn)有的降糖藥物雖然有一定的降糖或改善胰島素抵抗的療效,但是都無法恢復(fù)胰島p細(xì)胞功能。即使接受系統(tǒng)、持續(xù)的治療,胰島功能也總是在不斷地衰退。因此,這些降糖藥物都只能延緩病情進(jìn)展,無法徹底修復(fù)胰島功能,使病情得到有效控制。 胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide1, GLP-1)是一種由腸上皮L細(xì)胞分泌的短肽激素,屬于腸促胰素的一種�，F(xiàn)已證明GLP-1具有刺激胰島p細(xì)胞增殖和胰島素分泌,抑制β細(xì)胞凋亡,提高肌肉、肝臟細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。另外,它還可以通過調(diào)控食欲、抑制能量吸收和動(dòng)員脂肪等多方面的作用來降低血糖和改善胰島素抵抗。GLP-1類似肽——利拉魯肽(liraglutide)和艾塞那肽(exenatide或extendin-4, EX4)現(xiàn)已成為肥胖和糖尿病防治的新藥。但是,目前GLP-1類似肽都是采用化學(xué)合成方法進(jìn)行生產(chǎn),離不開多肽的分離純化工藝,只能注射途徑給藥,不能口服,存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高和使用不便的缺點(diǎn)。迫切地需要改進(jìn)GLP-1類似肽的生產(chǎn)和給藥方式,降低藥物副作用。 雙歧桿菌是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最安全、最有益于身體健康的益生菌群之一,是人體腸道的第一批居民,是嬰幼兒腸道中主要菌群。雙歧桿菌不僅具有改善腸道微生態(tài)環(huán)境、抑制致病菌生長(zhǎng),促進(jìn)營養(yǎng)吸收的作用,而且還具有免疫調(diào)理、分解有毒的代謝中間產(chǎn)物和預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用。雙歧桿菌作為食品、藥品已經(jīng)有幾百年的歷史,其安全性也得到充分驗(yàn)證。以雙歧桿菌為宿主菌來表達(dá)功能多肽是最安全、最簡(jiǎn)便的途徑,有利于長(zhǎng)期用藥。因此,我們利用雙歧桿菌來表達(dá)GLP-1類似肽,并探討其降血糖和改善胰島素抵抗的療效。 在已建立的雙歧桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了GLP-1改構(gòu)肽GLP-1(8G)和類似肽EX4雙歧桿菌表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化獲得,攜帶有GLP-1(8G)和EX4基因的轉(zhuǎn)化雙歧桿菌。體外分析雙歧桿菌表達(dá)的GLP-1(8G)和EX4的表達(dá)表達(dá)規(guī)律及生物學(xué)活性；體內(nèi)對(duì)高脂高糖飲食和鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病模型小鼠的治療實(shí)驗(yàn)觀測(cè)其降糖的療效,并探討其分子作用機(jī)制。具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如下：(1)選擇以往實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建好的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒載體pBBADs-EV與化學(xué)合成的GLP-1改構(gòu)肽GLP-1(8G)和類似肽EX4基因片段,構(gòu)建并測(cè)序鑒定pBBADs-GLP-1(8G)與pBBADs-EX4穿梭質(zhì)粒,將pBBADs-GLP-1(8G)與pBBADs-EX4質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC2705)中,厭氧培養(yǎng)48h后,篩選出陽性克隆菌落。GLP-1(8G)轉(zhuǎn)化雙歧桿菌命名為BL-GLP-1(8G); EX4轉(zhuǎn)化雙歧桿菌命名為BL-EX4;空載體pBBADs-EV轉(zhuǎn)化雙歧桿菌命名為BL-EV。把轉(zhuǎn)化雙歧桿菌接種到含有氨芐青霉素的MRS培養(yǎng)基當(dāng)中,以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)表達(dá)12h、24h、36h后,分別用ELISA和Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌中的GLP-1(8G)與EX4蛋白表達(dá)水平,并選擇最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。(2)在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的INS-1細(xì)胞(ratinsulinoma cell)中加入含有BL-GLP-1(8G)與BL-EX4誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)上清,用CCK-8細(xì)胞毒性試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。(3) BL-GLP-1(8G)與BL-EX4分泌蛋白的體外生物學(xué)活性試驗(yàn)：將轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)培養(yǎng)的上清培養(yǎng)INS-1細(xì)胞24h,48h后,運(yùn)用ELISA測(cè)定培養(yǎng)液中胰島素含量的變化情況。(4) BL-GLP-1(8G)與BL-EX4分泌蛋白的模型動(dòng)物治療功能性試驗(yàn)：運(yùn)用高脂高糖喂食C57BL/6J小鼠后,腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ),成功造成2型糖尿病模型后,分組后給予小鼠灌胃0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)表達(dá)后的BL-GLP-1(8G)與BL-EX4連續(xù)治療28天,以BL-EV組為陽性對(duì)照。①2型糖尿病小鼠的造模與判定：用高糖高脂飼料飼養(yǎng)小鼠48天后,以10mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)的劑量腹腔注射,禁食12h后,剪鼠尾取血,使用血糖儀測(cè)定血糖,并達(dá)到了糖尿病小鼠非空腹血糖的成膜標(biāo)準(zhǔn)(11.1mmol/L)者被初步判定為2型糖尿病小鼠,并繼續(xù)高脂高糖喂食；②灌胃0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)誘導(dǎo)表達(dá)后的BL-GLP-1(8G)與BL-EX4連續(xù)治療28天,摘眼球取血,2000rpm低溫離心10min,取血漿保存于4℃冰箱,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)等生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)；③處理小鼠時(shí),取各組新鮮的肝組織,迅速放入液氮。從液氮中取出的肝組織,剪取各組組織100mg左右,放入研磨皿中研磨,加入Triol提取組織中的RNA,立即逆轉(zhuǎn)錄成DNA,運(yùn)用熒光定量PCR的方法檢測(cè)Adiponectin (脂聯(lián)素)、Adiponectin acceptor(脂聯(lián)素受體)和Resistin (抵抗素)在肝組織中的表達(dá)水平；油紅O染色法分析脂肪肝病變程度；④各取一部分肝臟組織,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,進(jìn)行HE染色對(duì)其肝組織的形態(tài)進(jìn)行分析；⑤取各組胰島部分,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切成10μm后,進(jìn)行免疫組化分析其經(jīng)過治療后的p胰島的形態(tài)與分泌情況變化。(5)驗(yàn)證GLP-1受體在小鼠結(jié)腸與INS-1細(xì)胞中存在：①剪取正常小鼠部分結(jié)腸,超聲裂解,低溫離心,取上清貯存在-20℃?zhèn)溆?運(yùn)用Western blot方法鑒定；②用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細(xì)胞48h后,超聲裂解后,低溫離心,運(yùn)用Western blot方法鑒定；③剪取正常小鼠部分結(jié)腸,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,進(jìn)行免疫組化處理鑒定；④取正常小鼠部分結(jié)腸,常規(guī)石蠟包埋,切成10μm后,按組織免疫熒光方法處理,封片后,運(yùn)用共聚照顯微鏡(confocal圖像)405/488nm波長(zhǎng)下拍照鑒定；⑤在6孔板中,常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)到狀態(tài)良好時(shí),按照細(xì)胞免疫熒光方法處理,運(yùn)用共聚照顯微鏡(confocal圖像)在405/488nm波長(zhǎng)下拍照鑒定； 研究結(jié)果顯示：(1)在長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC2705)中,成功構(gòu)建了能夠分泌GLP-1改構(gòu)肽GLP-1(8G)和類似肽EX4的雙歧桿菌BL-GLP-1(8G)與BL-EX4傳遞體；經(jīng)過挑選鑒定的BL-GLP-1(8G)和BL-EX4轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌在生物與形態(tài)學(xué)上并沒有顯著的改變。經(jīng)過L-阿拉伯糖體外誘導(dǎo)后,其分泌的蛋白,能夠在轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌的上清與菌體中檢測(cè)出來,測(cè)定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)式時(shí)間是24h。(2) BL-GLP-1(8G)與BL-EX4經(jīng)過0.2%L-Ara誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)上清對(duì)INS-1細(xì)胞有增殖作用,且ELISA檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清,證明其誘導(dǎo)后的培養(yǎng)上清胰島素的量顯著升高。(3)空腹血糖、口服葡萄糖糖耐量實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過灌胃BL-GLP-1(8G)和BL-EX4的T2DM的小鼠,相對(duì)灌胃BL-EV的T2DM小鼠來說有顯著效果(P0.05)。(4)對(duì)于血漿的生化檢測(cè),與BL-EV組相比,灌胃BL-GLP-1(8G)治療的小鼠的VLDL、TG、LDL都有顯著的變化。(5)與BL-EV組相比,經(jīng)過灌胃BL-GLP-1(8G)和BL-EX4治療28天后,ELISA法證明血清中的Adiponectin(脂聯(lián)素)水平有顯著性升高。(6)運(yùn)用Western blot,共聚照顯微鏡(confocal)與免疫組化的方法,證明INS-1細(xì)胞與C57BL/6J小鼠結(jié)腸上確實(shí)存在相同的GLP-1R受體。 總之,我們成功構(gòu)建了攜帶有GLP-1(8G)和EX4的雙歧桿菌表達(dá)載體,并篩選獲得目的基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌；在基因轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的菌體與培養(yǎng)上清能夠檢測(cè)到GLP-1(8G)和EX4的表達(dá)；體外實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化雙歧桿菌的GLP-1(8G)和EX4表達(dá)產(chǎn)物能促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖,并刺激胰島素分泌；體內(nèi)對(duì)高脂高糖飲食和STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型小鼠的治療實(shí)驗(yàn)證實(shí),口服GLP-1(8G)和EX4轉(zhuǎn)化雙歧桿菌可以觀測(cè)其降糖的療效,并探討其分子作用機(jī)制。 相對(duì)于目前在市面上的GLP-1類似物注射劑,轉(zhuǎn)基因BL-GLP-1(8G)口BL-EX4具備了體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)腸上受體直接吸收,減少腎毒性的發(fā)生；生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,不需任何提取純化即可服用,降低了生產(chǎn)純化成本,提高社會(huì)效益；只需通過口服等方式,簡(jiǎn)便、無毒、無痛,可以明顯地降低疼痛感,增強(qiáng)其適應(yīng)性；在體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá),降低其半衰期短的缺點(diǎn),可不問斷發(fā)揮作用,治療效果顯著。結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的療效結(jié)果來看,可預(yù)想到未來可對(duì)人類的2型糖尿病的治療,具有十分具大的發(fā)展?jié)摿�。因�?BL-GLP-1(8G)與BL-EX4有望成為擁有GLP-1類似物對(duì)糖尿病的治療作用的一種新劑型,并且能夠調(diào)節(jié)病人腸道微生物的新一代益生菌。
【關(guān)鍵詞】：T2DM 長(zhǎng)雙歧桿菌 GLP-1 改構(gòu)肽 GLP-1(8G)和類似肽 EX4 轉(zhuǎn)化雙歧桿菌 GLP-1R受體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R587.1;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-32
• 實(shí)驗(yàn)方法32-47
• 結(jié)果47-64
• 討論64-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-79
• 攻讀學(xué)位期間參與發(fā)表的文章79-80
• 英文縮略詞表80-82
• 附圖82-91
• 致謝91-92

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 何明清,謝鏡懷,朱玉蘭,張明偉,康白;病、健仔豬不同腸段菌群的研究[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);1986年04期

2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組;非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)[J];中華肝臟病雜志;2003年02期

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本文編號(hào)：1013233