發(fā)布時(shí)間：2017-10-09 13:06

  本文關(guān)鍵詞：AMPK在線粒體中的分布及線粒體中AMPKα1對(duì)細(xì)胞自噬的影響

  更多相關(guān)文章： AMPK 線粒體 亞細(xì)胞定位 自噬

【摘要】：背景和目的： 5’單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是細(xì)胞的能量感受器，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中均發(fā)揮重要的生物功能，它的激活有助于糾正代謝紊亂，使其代謝趨向生理平衡。在細(xì)胞應(yīng)急反應(yīng)中，細(xì)胞感受到能量危機(jī), ATP濃度下降，AMP濃度上升，細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比例上升，AMPK被激活；在病理狀態(tài)下，如代謝綜合征、腫瘤等，常伴隨能量代謝失調(diào)，AMPK活性下降，此時(shí)，藥物激活A(yù)MPK可以使能量代謝恢復(fù)正常。因此，，AMPK被視為治療代謝性疾病與腫瘤的作用靶點(diǎn)。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，參與人體眾多生理與病理過(guò)程，而AMPK對(duì)能量代謝的調(diào)節(jié)與線粒體的功能密不可分。越來(lái)越多研究表明，線粒體能影響AMPK的活性，同時(shí)AMPK也通過(guò)多方面對(duì)線粒體進(jìn)行調(diào)節(jié)。但AMPK能否通過(guò)直接結(jié)合在細(xì)胞線粒體內(nèi)而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，目前尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在解決這一問(wèn)題并探明某些特定的功能是否歸因于線粒體AMPK。 方法: 1. AMPK在線粒體的定位。采用免疫印跡和免疫熒技術(shù)檢測(cè)AMPK在線粒體的定位。為檢測(cè)AMPK定位于線粒體的決定片段，我們使HEK-293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)AMPKα1亞基各片段，采用生化方法檢測(cè)各片段是否定位于線粒體內(nèi)。 2.線粒體中AMPK的功能。為此目的，設(shè)計(jì)以慢病毒為載體，含有持續(xù)激活的AMPKα1亞基的重組病毒，且在該持續(xù)激活的亞基上連接靶向線粒體的肽段且在亞基氨基酸末端連接Flag抗原決定簇；將該重組病毒轉(zhuǎn)染于肺癌細(xì)胞系-A549細(xì)胞中。隨后研究線粒體AMPK對(duì)自噬的影響。 結(jié)果： 1.內(nèi)源性AMPK包括α亞基和β亞基不僅分布于其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也分布在線粒體上。 2. AMPKα1與線粒體的結(jié)合位點(diǎn)在其羧基末端的392-548氨基酸殘基之間，該結(jié)合位點(diǎn)與亞基上的β亞基結(jié)合位點(diǎn)相重疊，由此表明α1亞基直接結(jié)合或者通過(guò)β亞基間接結(jié)合到線粒體上。 3.線粒體靶向募集活性AMPK可以在無(wú)糖條件下增強(qiáng)自噬，表明線粒體AMPK在自噬中發(fā)揮重要作用。 結(jié)論： 1. AMPK存在于線粒體內(nèi)且AMPKα1定位于線粒體的決定片段為其羧基末端：391-548氨基酸序列； 2. AMPK在線粒體內(nèi)對(duì)自噬發(fā)揮重要作用，表明在無(wú)糖時(shí)保護(hù)細(xì)胞；
【關(guān)鍵詞】：AMPK 線粒體 亞細(xì)胞定位 自噬
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-14
• 第2章 材料與方法14-26
• 2.1 材料14-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料14
• 2.1.2. 主要試劑14-16
• 2.1.3 主要儀器16-17
• 2.2 方法17-25
• 2.2.1 主要溶液的配制17-19
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-25
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理25-26
• 第3章 結(jié)果26-32
• 3.1 AMPKβ在 A549 和 293AD 細(xì)胞中的分布26
• 3.2 免疫印跡法檢測(cè) AMPK 在 SD 大鼠及 A549 細(xì)胞線粒體內(nèi)的分布26-27
• 3.3 AMPKα1 的線粒體結(jié)合片段27-28
• 3.4 線粒體上的 AMPKα1 對(duì) A549 細(xì)胞自噬的影響28-32
• 第4章 討論32-35
• 4.1 AMPK 在線粒體內(nèi)的定位32-33
• 4.2 線粒體中 AMPK 對(duì)細(xì)胞自噬的影響33-35
• 第5章 結(jié)論35-36
• 致謝36-37
• 參考文獻(xiàn)37-40
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果40-41
• 綜述41-57
• 參考文獻(xiàn)53-57

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