本文關鍵詞：氯化血紅素誘導的血紅素加氧酶-1在膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮中的作用

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【摘要】：【研究目的】肌萎縮是膿毒癥患者遠期和嚴重并發(fā)癥之一,嚴重影響患者生活質量。膿毒癥導致肌纖維蛋白分解加速是肌萎縮發(fā)生的重要原因。泛素/蛋白酶體系統(tǒng)活性升高,促炎細胞因子高表達和氧化應激損傷等是膿毒癥時肌纖維降解加速的主要原因。氯化血紅素(Hemin)可誘導血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)表達升高。HO-1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,但其對膿毒癥相關肌萎縮是否有保護作用尚無報道。本文首先通過觀察膿毒癥小鼠后肢肌肉萎縮程度及病理學改變,研究Hemin是否對膿毒癥相關肌萎縮具有保護作用;其次,通過測定小鼠外周血促炎細胞因子、骨骼肌HO-1及肌萎縮相關分子表達水平等,探究Hemin在膿毒癥相關肌萎縮中的可能作用機制�！狙芯糠椒ā�1、建立小鼠盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)膿毒癥模型,并按不同處理方式分為四組:對照組、CLP組、Hemin組及鋅原卟啉(ZnPP,HO-1抑制劑)組。其中,對照組及CLP組小鼠予以腹腔注射2%DMSO水溶液200μl處理;Hemin組小鼠予以腹腔注射Hemin(50mg/kg)200μl;ZnPP組腹腔注射Hemin(50mg/kg)和ZnPP(20mg/kg)共200μl。其中,對照組小鼠僅探查腸管未結扎穿孔。各組小鼠給藥時間為術前5d、3d、1d。此實驗手術及取材前小鼠均在2%~3%七氟烷全麻后進行。2、術后3d取各組小鼠后肢,分離皮膚后大體觀察骨骼肌形態(tài);手術當日及術后1d、3d、5d和7d時,分離小鼠比目魚肌并稱量肌肉濕重,初步判斷各組小鼠骨骼肌萎縮程度及變化。3、術后24h利用酪氨酸測定法,測定各組小鼠比目魚肌降解后釋放的酪氨酸濃度,以分析骨骼肌蛋白降解程度。4、術后5d取小鼠脛骨前肌,使用4%多聚甲醛固定并作石蠟切片,在光學顯微鏡下觀察并計算各組小鼠骨骼肌纖維橫截面積變化。5、分別于術后1d、4d和7d時分離小鼠脛骨前肌,采用實時定量PCR法(RT-PCR)測定骨骼肌組織HO-1的mRNA表達水平;術后1d取小鼠脛骨前肌,使用Western蛋白印記方法(Western-Blot)測定骨骼肌HO-1蛋白表達水平;術后24h測定小鼠脛骨前肌膽紅素水平,以評估HO-1活性。6、術后24h時經小鼠心臟取血,使用血漿酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組小鼠外周血IL-6及TNF-α濃度。7、分別于術后1d、4d和7d時采用RT-PCR法測定小鼠脛骨前肌萎縮相關-2-基因-1(atrogin-1)和肌肉環(huán)狀指分子1(murf1)的mrna表達水平;術后1d使用western-blot法測定脛骨前肌atrogin-1和murf1的蛋白表達水平。8、術后24h在全麻下迅速分離小鼠脛骨前肌,液氮凍存。使用分光光度計法測定肌組織丙二醛(malonaldehyde,mda)濃度和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活性,分析各組小鼠骨骼肌氧化應激損傷程度�！窘Y果】1、術后3dclp組小鼠后肢較對照組顯著變細,hemin組較clp組有所改善;znpp組小鼠后肢與clp組相似,均發(fā)生較顯著的肌萎縮現(xiàn)象。對照組小鼠在術后0d~7d內比目魚肌重量無顯著改變,clp組比目魚肌重量呈顯著下降,hemin組比目魚肌重量也呈下降趨勢,然較clp組下降程度減慢,術后3d、5d和7d時與clp組比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。znpp組與clp組小鼠比目魚肌重量下降差異無統(tǒng)計學意義。2、使用酪氨酸測定法檢測肌肉分解所釋放的酪氨酸濃度,結果顯示clp組酪氨酸濃度高于對照組近2倍(p0.01),hemin組酪氨酸濃度較clp組低(p0.01),znpp組酪氨酸濃度高于對照組和hemin組,但與clp組比較差異無統(tǒng)計學意義。3、光學顯微鏡下觀察小鼠脛骨前肌橫截面,發(fā)現(xiàn)clp組和znpp組肌纖維較對照組顯著變細,hemin組肌纖維較clp組改善。計算各組肌纖維橫截面積,結果顯示clp組較對照組顯著縮小(p0.01),hemin組肌纖維面積較clp組增大(p0.01),znpp組橫截面積較hemin組減小(p0.05),與clp組相比差異無統(tǒng)計學意義。4、各組小鼠外周血elisa結果顯示,術后24hclp組小鼠il-6及tnf-α水平顯著高于對照組(p0.01),hemin組il-6及tnf-α水平低于clp組(p0.01),znpp組上述兩種炎性因子表達水平與clp組差異無統(tǒng)計學意義。5、rt-pcr結果顯示,術后1d、4d和7d時hemin組和znpp組骨骼肌ho-1mrna表達水平均高于對照組和clp組(p0.01),但ho-1表達整體呈下降趨勢。hemin組骨骼肌atrogin-1和murf1表達水平均顯著低于clp組(p0.01)。通過測定膽紅素濃度分析ho-1活性,發(fā)現(xiàn)術后24hhemin組肌肉ho-1活性高于clp組(p0.01),但znpp組ho-1活性顯著低于hemin組(p0.01)。6、western-blot結果顯示,clp組小鼠骨骼肌組織ho-1蛋白表達略高于對照組,hemin組和znpp組ho-1表達顯著高于對照組和clp組。clp組肌組織atrogin-1和murf1蛋白表達均顯著高于對照組,hemin組兩者表達均低于clp組,znpp組atrogin-1和murf1均為高表達(p0.01)。7、clp組小鼠脛骨前肌mda濃度顯著高于對照組(p0.05),hemin組mda濃度低于CLP組(P0.05),ZnPP組MDA濃度與CLP組比較差異無統(tǒng)計學意義。SOD活性測定顯示Hemin組小鼠骨骼肌組織SOD活性高于CLP組(P0.01),ZnPP組SOD活性與CLP組比較差異無統(tǒng)計學意義�！窘Y論】Hemin可減輕膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮程度,其機制可能與Hemin誘導小鼠骨骼肌HO-1高表達和活性增加有關。HO-1活性增加可抑制促炎細胞因子IL-6及TNF-α分泌,降低泛素/蛋白酶系統(tǒng)中肌萎縮相關分子Atrogin-1和MuRF1的表達,并減輕骨骼肌組織氧化應激損傷,從而對膿毒癥誘導的骨骼肌萎縮產生一定的保護作用。
【關鍵詞】：氯化血紅素 血紅素加氧酶-1 膿毒癥 肌萎縮 泛素/蛋白酶系統(tǒng) 氧化應激
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞中英文對照表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 氯化血紅素對膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮的影響15-27
• 材料與方法15-21
• 結果21-25
• 討論25-27
• 第二部分 氯化血紅素改善膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮的機制研究27-46
• 材料與方法27-36
• 結果36-43
• 討論43-46
• 全文總結46-47
• 參考文獻47-51
• 文獻綜述51-59
• 參考文獻55-59
• 發(fā)表論文和參與科研工作情況59-60
• 致謝60-61

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本文編號：979957