本文關(guān)鍵詞：氯化血紅素誘導(dǎo)的血紅素加氧酶-1在膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮中的作用

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【摘要】：【研究目的】肌萎縮是膿毒癥患者遠(yuǎn)期和嚴(yán)重并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。膿毒癥導(dǎo)致肌纖維蛋白分解加速是肌萎縮發(fā)生的重要原因。泛素/蛋白酶體系統(tǒng)活性升高,促炎細(xì)胞因子高表達(dá)和氧化應(yīng)激損傷等是膿毒癥時(shí)肌纖維降解加速的主要原因。氯化血紅素(Hemin)可誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)表達(dá)升高。HO-1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,但其對(duì)膿毒癥相關(guān)肌萎縮是否有保護(hù)作用尚無(wú)報(bào)道。本文首先通過(guò)觀(guān)察膿毒癥小鼠后肢肌肉萎縮程度及病理學(xué)改變,研究Hemin是否對(duì)膿毒癥相關(guān)肌萎縮具有保護(hù)作用;其次,通過(guò)測(cè)定小鼠外周血促炎細(xì)胞因子、骨骼肌HO-1及肌萎縮相關(guān)分子表達(dá)水平等,探究Hemin在膿毒癥相關(guān)肌萎縮中的可能作用機(jī)制�！狙芯糠椒ā�1、建立小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)膿毒癥模型,并按不同處理方式分為四組:對(duì)照組、CLP組、Hemin組及鋅原卟啉(ZnPP,HO-1抑制劑)組。其中,對(duì)照組及CLP組小鼠予以腹腔注射2%DMSO水溶液200μl處理;Hemin組小鼠予以腹腔注射Hemin(50mg/kg)200μl;ZnPP組腹腔注射Hemin(50mg/kg)和ZnPP(20mg/kg)共200μl。其中,對(duì)照組小鼠僅探查腸管未結(jié)扎穿孔。各組小鼠給藥時(shí)間為術(shù)前5d、3d、1d。此實(shí)驗(yàn)手術(shù)及取材前小鼠均在2%~3%七氟烷全麻后進(jìn)行。2、術(shù)后3d取各組小鼠后肢,分離皮膚后大體觀(guān)察骨骼肌形態(tài);手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后1d、3d、5d和7d時(shí),分離小鼠比目魚(yú)肌并稱(chēng)量肌肉濕重,初步判斷各組小鼠骨骼肌萎縮程度及變化。3、術(shù)后24h利用酪氨酸測(cè)定法,測(cè)定各組小鼠比目魚(yú)肌降解后釋放的酪氨酸濃度,以分析骨骼肌蛋白降解程度。4、術(shù)后5d取小鼠脛骨前肌,使用4%多聚甲醛固定并作石蠟切片,在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)算各組小鼠骨骼肌纖維橫截面積變化。5、分別于術(shù)后1d、4d和7d時(shí)分離小鼠脛骨前肌,采用實(shí)時(shí)定量PCR法(RT-PCR)測(cè)定骨骼肌組織HO-1的mRNA表達(dá)水平;術(shù)后1d取小鼠脛骨前肌,使用Western蛋白印記方法(Western-Blot)測(cè)定骨骼肌HO-1蛋白表達(dá)水平;術(shù)后24h測(cè)定小鼠脛骨前肌膽紅素水平,以評(píng)估HO-1活性。6、術(shù)后24h時(shí)經(jīng)小鼠心臟取血,使用血漿酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各組小鼠外周血IL-6及TNF-α濃度。7、分別于術(shù)后1d、4d和7d時(shí)采用RT-PCR法測(cè)定小鼠脛骨前肌萎縮相關(guān)-2-基因-1(atrogin-1)和肌肉環(huán)狀指分子1(murf1)的mrna表達(dá)水平;術(shù)后1d使用western-blot法測(cè)定脛骨前肌atrogin-1和murf1的蛋白表達(dá)水平。8、術(shù)后24h在全麻下迅速分離小鼠脛骨前肌,液氮凍存。使用分光光度計(jì)法測(cè)定肌組織丙二醛(malonaldehyde,mda)濃度和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活性,分析各組小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷程度�！窘Y(jié)果】1、術(shù)后3dclp組小鼠后肢較對(duì)照組顯著變細(xì),hemin組較clp組有所改善;znpp組小鼠后肢與clp組相似,均發(fā)生較顯著的肌萎縮現(xiàn)象。對(duì)照組小鼠在術(shù)后0d~7d內(nèi)比目魚(yú)肌重量無(wú)顯著改變,clp組比目魚(yú)肌重量呈顯著下降,hemin組比目魚(yú)肌重量也呈下降趨勢(shì),然較clp組下降程度減慢,術(shù)后3d、5d和7d時(shí)與clp組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。znpp組與clp組小鼠比目魚(yú)肌重量下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、使用酪氨酸測(cè)定法檢測(cè)肌肉分解所釋放的酪氨酸濃度,結(jié)果顯示clp組酪氨酸濃度高于對(duì)照組近2倍(p0.01),hemin組酪氨酸濃度較clp組低(p0.01),znpp組酪氨酸濃度高于對(duì)照組和hemin組,但與clp組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察小鼠脛骨前肌橫截面,發(fā)現(xiàn)clp組和znpp組肌纖維較對(duì)照組顯著變細(xì),hemin組肌纖維較clp組改善。計(jì)算各組肌纖維橫截面積,結(jié)果顯示clp組較對(duì)照組顯著縮小(p0.01),hemin組肌纖維面積較clp組增大(p0.01),znpp組橫截面積較hemin組減小(p0.05),與clp組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、各組小鼠外周血elisa結(jié)果顯示,術(shù)后24hclp組小鼠il-6及tnf-α水平顯著高于對(duì)照組(p0.01),hemin組il-6及tnf-α水平低于clp組(p0.01),znpp組上述兩種炎性因子表達(dá)水平與clp組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、rt-pcr結(jié)果顯示,術(shù)后1d、4d和7d時(shí)hemin組和znpp組骨骼肌ho-1mrna表達(dá)水平均高于對(duì)照組和clp組(p0.01),但ho-1表達(dá)整體呈下降趨勢(shì)。hemin組骨骼肌atrogin-1和murf1表達(dá)水平均顯著低于clp組(p0.01)。通過(guò)測(cè)定膽紅素濃度分析ho-1活性,發(fā)現(xiàn)術(shù)后24hhemin組肌肉ho-1活性高于clp組(p0.01),但znpp組ho-1活性顯著低于hemin組(p0.01)。6、western-blot結(jié)果顯示,clp組小鼠骨骼肌組織ho-1蛋白表達(dá)略高于對(duì)照組,hemin組和znpp組ho-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組和clp組。clp組肌組織atrogin-1和murf1蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,hemin組兩者表達(dá)均低于clp組,znpp組atrogin-1和murf1均為高表達(dá)(p0.01)。7、clp組小鼠脛骨前肌mda濃度顯著高于對(duì)照組(p0.05),hemin組mda濃度低于CLP組(P0.05),ZnPP組MDA濃度與CLP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SOD活性測(cè)定顯示Hemin組小鼠骨骼肌組織SOD活性高于CLP組(P0.01),ZnPP組SOD活性與CLP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�！窘Y(jié)論】Hemin可減輕膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮程度,其機(jī)制可能與Hemin誘導(dǎo)小鼠骨骼肌HO-1高表達(dá)和活性增加有關(guān)。HO-1活性增加可抑制促炎細(xì)胞因子IL-6及TNF-α分泌,降低泛素/蛋白酶系統(tǒng)中肌萎縮相關(guān)分子Atrogin-1和MuRF1的表達(dá),并減輕骨骼肌組織氧化應(yīng)激損傷,從而對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：氯化血紅素 血紅素加氧酶-1 膿毒癥 肌萎縮 泛素/蛋白酶系統(tǒng) 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞中英文對(duì)照表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 氯化血紅素對(duì)膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮的影響15-27
• 材料與方法15-21
• 結(jié)果21-25
• 討論25-27
• 第二部分 氯化血紅素改善膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮的機(jī)制研究27-46
• 材料與方法27-36
• 結(jié)果36-43
• 討論43-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 文獻(xiàn)綜述51-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 發(fā)表論文和參與科研工作情況59-60
• 致謝60-61

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本文編號(hào)：979957