目的皮膚是人體中最大的器官,覆蓋整個(gè)機(jī)體體表,重量約占身體總質(zhì)量的16%。皮膚由表皮、真皮、皮下組織與附件構(gòu)成,主要作用有保護(hù)機(jī)體抵抗外界有害物質(zhì)入侵、體溫調(diào)節(jié)等。作為與周圍環(huán)境密切接觸的器官,皮膚在日常中容易遭受到燒(燙)傷。大面積深度燒傷皮膚喪失其原有組織結(jié)構(gòu)與功能,皮膚中具備修復(fù)潛能的干細(xì)胞與組織遭受到嚴(yán)重破壞,使其自身潛在的自我修復(fù)能力也隨之減弱或喪失。目前對(duì)于大面積深度燒傷創(chuàng)面的處理仍存在不少困擾,如可供移植自體皮膚來源不足、異種或異體皮存在免疫排斥反應(yīng)與傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)、不能永久替代、價(jià)格昂貴與創(chuàng)面愈合后瘢痕攣縮影響外觀與功能等。臨床證實(shí)燒傷后采用磨痂、削痂術(shù)等方法去除燒傷壞死層與保留燒傷變性真皮有利于促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合,而且創(chuàng)面愈合后質(zhì)量更接近正常皮膚,其中的愈合機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜目前仍未完全闡述清楚。在深Ⅱ°或混合度燒傷中,部分真皮層并未完全壞死,只是其中細(xì)胞發(fā)生部分或一過性功能障礙,以及形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,但當(dāng)在局部微環(huán)境得到改善后,上述現(xiàn)象會(huì)好轉(zhuǎn)或消失,受損真皮可以逆轉(zhuǎn)恢復(fù)回正常的形態(tài)和功能,說明燒傷后的變性真皮層在一定條件下具有恢復(fù)為正常真皮結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能的潛能。為減少感染來源,目前臨床中早期削切痂往往會(huì)將變性真皮與完全壞死組織一并給予削除,如此不僅會(huì)造成可能逆轉(zhuǎn)的變性真皮浪費(fèi),而且創(chuàng)面愈合后也常常導(dǎo)致瘢痕增生明顯,造成燒傷患者外觀與功能障礙。前期研究證實(shí)經(jīng)離體脫細(xì)胞等技術(shù)處理后的燒傷變性真皮基質(zhì)生物性能尚可、初步移植效果滿意,認(rèn)為可能是一種潛在的燒傷真皮替代材料。隨著研究深入發(fā)現(xiàn)仍有許多未知之處需要進(jìn)一步研究弄清。真皮取材時(shí)機(jī)的影響、如何更好地處理燒傷變性真皮基質(zhì)以優(yōu)化其生物性能、提高移植效果與弄清經(jīng)處理后的不同時(shí)期取材制備的變性真皮基質(zhì)中細(xì)胞因子等仍有待研究。基于前期燒傷變性真皮基質(zhì)研究為基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)擬將早期削切痂廢棄的燒傷變性真皮回收,應(yīng)用0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton-100聯(lián)合脫細(xì)胞處理,再給予激光微孔技術(shù)處理,制備成激光微孔脫細(xì)胞燒傷變性真皮基質(zhì)(Laser micropore denatured acellular dermal matrix,LPDADM),對(duì) LPDADM 進(jìn)行生物性能檢測(cè)、在體埋植、聯(lián)合自體刃厚皮移植研究,并應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)對(duì)LPDADM蛋白因子進(jìn)行檢測(cè),從而對(duì)其生物性能與移植效果、取材時(shí)機(jī)與移植后修復(fù)機(jī)制進(jìn)行評(píng)估、探討。本研究是系列燒傷變性真皮基質(zhì)研究的完善與深化,研究結(jié)果將為下一步變性真皮基質(zhì)基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用與組織工程化提供理論基礎(chǔ)。方法1.LPDADM的制備與性能檢測(cè)SPF級(jí)昆明雄性小鼠采用恒溫水浴燙傷法進(jìn)行深Ⅱ°燒傷動(dòng)物建模。于致傷后設(shè)定時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)小鼠,取下燒傷部位皮膚,修剪去除完全壞死表皮與組織,切取部分組織行組織病理學(xué)檢查,保留符合深Ⅱ°燒傷樣本。經(jīng)0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton X-100聯(lián)合處理15min后,用PBS滴定直至液體完全清亮。隨機(jī)將上述處理的真皮基質(zhì)分為兩組,其中任一組[標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組,另一組為對(duì)照組(DADM,Denatured acellular dermal matrix,變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì))],實(shí)驗(yàn)組采用特定紫外激光模板打孔技術(shù),在脫細(xì)胞變性真皮基質(zhì)上打孔,孔間隙設(shè)計(jì)為1.0mm,孔徑大小為135 μ m,制備成LPDADM。對(duì)比觀察DADM與LPDADM的顏色、質(zhì)地、彈韌性與延展性等性狀。切取組織行HE染色與光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和纖維排列等,并進(jìn)行相應(yīng)生物性能檢測(cè)。2.應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)取材制備的LPDADM蛋白因子表達(dá)差異于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物燒傷后未感染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)與確診燒傷創(chuàng)面感染時(shí)取材。制備成LPDADM后分別進(jìn)行蛋白因子檢測(cè),研究其中不同時(shí)期取材制備成的LPDADM中蛋白因子表達(dá)差異。3.LPDADM在體皮下埋植實(shí)驗(yàn)研究采用皮下埋植方法觀察兩組處理后的真皮基質(zhì)在體內(nèi)的組織相容性和免疫排斥反應(yīng)等。在小鼠背部?jī)蓚?cè)分別取2個(gè)皮下囊,一側(cè)囊內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)組LPDADM,另一側(cè)囊內(nèi)植入對(duì)照組DADM,互相不接觸。觀察指標(biāo):(1)埋植后第1、2、3、4周觀察兩組真皮基質(zhì)外觀、質(zhì)地、彈性、纖維包裹以及表面毛細(xì)血管生長(zhǎng)情況;(2)埋植后第1、2、3、4周光鏡下對(duì)比觀察兩組變性真皮基質(zhì)的細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原排列與毛細(xì)血管植入等情況。4.LPDADM聯(lián)合自體刃厚皮移植效果研究本部分研究由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)兩部分組成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:將小鼠分為兩組,麻醉后在其背部裁剪出一塊1 ×2cm2大小皮片,將同種異體LPDADM、DADM分別移植于兩組動(dòng)物皮膚缺損區(qū)域,然后將裁剪出的皮片刮除大部分真皮層修薄后覆蓋縫合于真皮替代材料上并打包加壓加扎,分別在術(shù)后10天、14天與21天給予觀察創(chuàng)面大體情況、組織學(xué)檢查、電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與對(duì)比觀察創(chuàng)面愈合率。試驗(yàn)部分:將入選的我科住院治療的深度燒傷需移植自體皮修復(fù)的成年患者,隨機(jī)分別應(yīng)用LPDADM聯(lián)合自體刃厚皮移植、HADM聯(lián)合自體刃厚皮移植、單純自體刃厚皮移植修復(fù)燒傷深度創(chuàng)面。術(shù)后定期觀察創(chuàng)面大體情況、組織學(xué)檢查、對(duì)比創(chuàng)面愈合率與主要實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果等,研究LPDADM應(yīng)用效果與安全性。結(jié)果1.大體標(biāo)本與鏡下觀察肉眼見新鮮制備的DADM呈瓷白色,質(zhì)地柔軟,具有一定彈性、韌性,再經(jīng)激光微孔處理后制備成的LPDADM呈現(xiàn)整齊密集的小孔,孔周未見炭化,瓷白色,質(zhì)地柔軟,具有一定彈韌性。光學(xué)顯微鏡下顯示DADM中未見上皮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞殘存,真皮膠原玻璃樣變性;LPDADM中未見上皮結(jié)構(gòu)和細(xì)胞殘存,真皮膠原見玻璃樣變性,局部見輕微膠原纖維斷裂現(xiàn)象。2.生物力學(xué)性能傷后24h時(shí)所取材制備的LPDADM的彈性模量(MPa)、最大負(fù)載力(N)與拉伸長(zhǎng)度(cm)分別為 71.60±2.30、118.00±3.54、2.48±0.23;48h 組三指標(biāo)結(jié)果分別為:70.20±2.85、107.30±6.15、2.52±0.18;72h組三指標(biāo)結(jié)果分別為:71.80±2.40、123.55±4.75、2.33±0.31;創(chuàng)面感染時(shí)所取材制備的 LPDADM 的彈性模量(MPa)、最大負(fù)載力(N)與拉伸長(zhǎng)度(cm)分別為:67.40±3.53、101.00±3.22、2.10±0.27,上述4組三指標(biāo)各自比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但均較未激光微孔化處理的DADM[彈性模量(MPa)35.80±2.17、最大負(fù)載力(N)67.40±3.51、拉伸長(zhǎng)度(cm)2.66±0.05]變化明顯,各自比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.不同時(shí)間點(diǎn)取材制備的LPDADM蛋白因子表達(dá)差異3.1 LPDADM蛋白成分分析顯示,不同的時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h與創(chuàng)面確定感染時(shí))所取材制備的LPDADM的蛋白因子表達(dá)有差異;隨著時(shí)間后移,取材所制備的LPDADM中大部分蛋白因子表達(dá)呈顯逐步上升趨勢(shì),如IL-15、CCL-8、GM-CSF與MMP-3因子等;3.2與24、48與72小時(shí)未感染組比較,在感染創(chuàng)面中取材制備的LPDADM除MMP-24/MT5-of MMP、VE-cadherin、TCK-1、IL6 與 VEGF 表達(dá)降低外,其余蛋白因子均表達(dá)增強(qiáng)。4.LPDADM在體研究結(jié)果在動(dòng)物體內(nèi)埋植示肉眼見兩組變性真皮基質(zhì)埋植后均未見收縮、卷曲,亦無明顯滲出、紅腫等現(xiàn)象發(fā)生。LPDADM組2周時(shí)可見埋植變性真皮基質(zhì)表面上一層分布著微細(xì)血管網(wǎng)的纖維薄膜。組織學(xué)檢查結(jié)果顯示,LPDADM組在細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管植入等方面有差異,實(shí)驗(yàn)組血管植入和纖維融合程度更明顯,二組仍均未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。LPDADM聯(lián)合自體刃厚皮動(dòng)物研究結(jié)果顯示,術(shù)后第10天LPDADM組皮片呈肉紅色,皮片基本成活,對(duì)照組局部呈散在黑色干性狀,局部顏色偏深。術(shù)后14天創(chuàng)面愈合率比較,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。DADM組瘢痕增生較明顯。HE染色顯示LPDADM血管化更明顯,炎癥反應(yīng)輕微,DADM組炎癥細(xì)胞多,血管化程度較低;電鏡結(jié)果顯示DADM組新生組織難以長(zhǎng)入,遷入的成纖維細(xì)胞極少,以炎癥細(xì)胞為主,LPDADM組中有及少量的炎癥細(xì)胞的遷入,而且遷入的成纖維細(xì)胞電鏡下呈現(xiàn)核大呈不規(guī)則形態(tài),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)布滿細(xì)胞液中。LPDADM聯(lián)合自體刃厚皮臨床試驗(yàn)研究結(jié)果顯示,與HADM組比較,相同時(shí)間下LPDADM組愈合創(chuàng)面稍大;LPDADM組中柔軟性(1.18±0.34)分、厚度(1.24±0.47)分與創(chuàng)面愈合時(shí)間(28.05±5.23)天均與其相應(yīng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果差別較大,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2組同種脫細(xì)胞真皮替代材料移植后血常規(guī)、生化指標(biāo)、細(xì)胞免疫與細(xì)胞因子無明顯差別(P0.05)。結(jié)論1.經(jīng)激光微孔技術(shù)處理后的燒傷變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)彈性模量、最大負(fù)載力增加,拉伸長(zhǎng)度縮短,具有較好的生物性能;2.蛋白成分分析顯示,不同時(shí)間點(diǎn)取材制備的激光微孔燒傷變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中蛋白因子表達(dá)有差異。早期、創(chuàng)面未感染時(shí)所取材制備的激光微孔燒傷變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)比創(chuàng)面感染時(shí)所取材制備的激光微孔燒傷變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中有利于創(chuàng)面愈合的蛋白因子表達(dá)高,可能更適宜于移植應(yīng)用;3.經(jīng)激光微孔技術(shù)處理后的燒傷變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)皮下埋植后發(fā)現(xiàn)其生物相容性良好、免疫排斥反應(yīng)低,比單純燒傷變性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)更有利于細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥消退、毛細(xì)血管植入;4.LPDADM聯(lián)合自體刃厚皮移植能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合,提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量且生物安全性可。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R644
【部分圖文】：

比較兩組真皮基質(zhì)的ＳＳ２０．０軟件包處理，組間差異的比，Ｐ＞０．０５為兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)義。??Ｍ肉眼見呈瓷白色，質(zhì)地柔軟，備的ＬＰＤＡＤＭ呈現(xiàn)整齊均勻密集質(zhì)地柔軟，彈性、軔性可。??一?■??

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???附圖?２：?ａ：?９０°Ｃ水浴燙傷?６ｓ?（Ｘ?４０），ｂ：?９０°Ｃ水浴燙傷?１２ｓ?（Ｘ４０），?ｃ：?９０°Ｃ水浴燙傷?１８ｓ?（Ｘ?４０）；??ｂ：皮膚表皮壞死，部分己脫落，真皮膠原部分發(fā)生變性，皮膚附屬器官大部分壞死。符合深??ＩＩ。燒傷模型。??＇＇．

基質(zhì)均未見收縮、卷曲情況發(fā)生，均未見明顯滲出、紅腫現(xiàn)象，２周時(shí)均可見埋??植的變性真皮基質(zhì)表面上一層分布著微小血管網(wǎng)的纖維薄膜［附圖４］。組織學(xué)檢??查結(jié)果顯示［附圖５］，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞浸潤(rùn)、血管植入等方面有差??２７??
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