本文關(guān)鍵詞：鈣離子介導(dǎo)線粒體損傷在熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用

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【摘要】：研究背景和目的：中暑(heat stroke)是指暴露在高溫環(huán)境中,機(jī)體未能作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的一系列急性疾病的統(tǒng)稱,也稱為急性熱致疾病(Heat-related illness),主要表現(xiàn)為熱痙攣、熱暈厥、熱衰竭等,嚴(yán)重時可發(fā)展為重癥中暑,直接威脅人們的生命。據(jù)統(tǒng)計(jì),2003年歐洲夏季熱浪期間,有超過約45000人死亡,其中三分之一死亡的直接原因是由中暑引起,為歐洲歷史上近100年來最嚴(yán)重的十大自然災(zāi)難之一。近年來,隨著全球氣候變暖以及熱浪襲擊的頻率和強(qiáng)度增加,中暑的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,并對公眾健康形成災(zāi)害性影響。而目前對于重癥中暑發(fā)病過程中導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷的病理機(jī)制尚不清楚,因而缺乏特殊、有效的早期臨床治療措施,這也是導(dǎo)致重癥中暑患者救治時間長、死亡率高的重要原因。因此,研究重癥中暑所致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的病理生理機(jī)制,可為重癥中暑的救治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路,對降低其致死、致殘率都十分重要。在中暑的發(fā)病過程中,熱作為最根本的刺激和致傷因素,對機(jī)體細(xì)胞的許多功能和結(jié)構(gòu)都會產(chǎn)生重要的影響；在分子水平上,足夠的熱暴露可導(dǎo)致蛋白變性；在細(xì)胞水平上,可損傷細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞骨架及細(xì)胞核,最終引起細(xì)胞凋亡或壞死。多項(xiàng)細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)證實(shí),高熱可以直接誘導(dǎo)機(jī)體組織損傷和細(xì)胞死亡,根據(jù)遭受高熱打擊的不同程度,細(xì)胞的死亡形式可以表現(xiàn)為凋亡或壞死；當(dāng)機(jī)體遭受極限溫度(49℃-50℃)的高熱打擊時,5分鐘內(nèi)可直接導(dǎo)致組織細(xì)胞的壞死；而在輕度的熱打擊時,主要是表現(xiàn)為激活凋亡信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為,中暑發(fā)病過程中組織細(xì)胞的損傷形式主要表現(xiàn)為凋亡；并且,越來越多的證據(jù)顯示凋亡可能在中暑的病理進(jìn)程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn),熱打擊可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的活化(Caspase家族蛋白)從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程；在熱應(yīng)激過程中產(chǎn)生的各種氧代謝產(chǎn)物、細(xì)胞因子、蛋白酶類等,可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活或抑制細(xì)胞存活或死亡的多條信號通路；熱打擊也可通過誘導(dǎo)DNA損傷而直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等。然而,這些研究在動物水平多限于熱打擊與凋亡之間的表象觀察,其中的具體啟動因素、各信號通路之間相互聯(lián)系的中間環(huán)節(jié)、影響因素以及損傷機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入探討；在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究多集中于腫瘤細(xì)胞株,針對于正常組織細(xì)胞與熱打擊之間的關(guān)系的研究還很少。鑒于目前全球氣候變暖以及世界范圍內(nèi)熱浪襲擊的頻率及強(qiáng)度增加,由高熱引起的疾病發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,并對公眾健康形成災(zāi)害性影響,因此,研究高熱與機(jī)體組織細(xì)胞損傷之間的關(guān)系具有深刻現(xiàn)實(shí)意義。血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)作為人體的重要器官,其完整性不但是維持血管通透的重要屏障,其結(jié)構(gòu)及功能受損在熱損傷早期中占有重要地位。中暑時,由于高熱刺激導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列急性、復(fù)雜的病理生理改變,機(jī)體微循環(huán)改變,引起VEC損傷,可誘發(fā)或加重MODS。同時,有研究顯示VEC是熱打擊時重要的反應(yīng)細(xì)胞,為中暑過程中最常見形態(tài)和功能變化的細(xì)胞之一,也是最早發(fā)生損傷的細(xì)胞。因此,VEC損傷作為中暑發(fā)病過程中一個突出特點(diǎn),在中暑發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。細(xì)胞以及動物實(shí)驗(yàn)研究顯示,熱打擊可引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生廣泛凋亡,提示VEC凋亡可能是機(jī)體由熱應(yīng)激的生理進(jìn)程向重癥中暑的病理進(jìn)程轉(zhuǎn)變的重要中間環(huán)節(jié)。我們前期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),重癥中暑患者存在嚴(yán)重的血管內(nèi)皮細(xì)胞VEC損傷,主要表現(xiàn)在外周血循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞(circulation endothelia cells,CEC)數(shù)量明顯升高；進(jìn)一步體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),建立了熱打擊人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),發(fā)現(xiàn)熱打擊對HUVEC細(xì)胞具有細(xì)胞毒效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制,并對高熱誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)熱打擊早期即誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)并介導(dǎo)P53快速移位至細(xì)胞線粒體,激活了線粒體凋亡通路,從而誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞廣泛凋亡；但在熱打擊過程中如何引起Ca2+失穩(wěn),以及其中可能存在的機(jī)制并沒有闡述,因此,高熱所致的內(nèi)皮損傷的凋亡機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究,本課題最終可為揭示中暑時VEC介導(dǎo)的病理過程奠定基礎(chǔ),為臨床預(yù)防及治療中暑提供理論依據(jù)。主要方法和結(jié)果：1.熱打擊對HUVEC細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒效應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷及凋亡收集對照組(37℃)及熱打擊組(39℃、41℃、43℃、45℃)細(xì)胞,采用水溶性四唑鹽(WST-1)法和乳酸脫氫酶(LDH)法檢測熱打擊對細(xì)胞損傷的影響,評價熱打擊對細(xì)胞的毒效應(yīng)。與對照組37℃比較,隨著熱打擊溫度增高(41℃～45℃),細(xì)胞活力呈現(xiàn)進(jìn)行性下降；細(xì)胞的LDH釋放呈溫度依懶性增高。使用Hoechst33258熒光染色檢測熱打擊后細(xì)胞凋亡情況,同樣發(fā)現(xiàn)隨著熱打擊溫度增高(41℃-43℃),HUVEC細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài),表現(xiàn)為胞核固縮,致密深染,染色質(zhì)邊集,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見亮藍(lán)色強(qiáng)熒光,細(xì)胞凋亡呈熱打擊溫度依賴性增加。進(jìn)一步使用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK,發(fā)現(xiàn)其可以明顯抑制熱打擊誘導(dǎo)的凋亡,表現(xiàn)為41℃+Z-DEVD-FMK組及43℃+Z-DEVD-FMK組HUVEC細(xì)胞內(nèi)亮藍(lán)色強(qiáng)熒光的凋亡細(xì)胞較之前明顯減少。為明確高熱對HUVEC細(xì)胞凋亡的影響并深入探索這其中可能存在的機(jī)制,我們選擇43℃(熱打擊2h)作為研究溫度,觀察熱打擊后不同復(fù)溫時間點(diǎn)(0h、 1h、3h、6h、9h)細(xì)胞凋亡表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HUVEC細(xì)胞在43℃熱打擊2h后,復(fù)溫3h時開始激活Caspase-3活性、PARP表達(dá)及DNA損傷,并在復(fù)溫6h時達(dá)到高峰,一直持續(xù)至9h,表明高熱可誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡,且呈復(fù)溫時間依賴性。2.熱打擊誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體損傷,激活內(nèi)源性凋亡通路為明確高熱是否對HUVEC細(xì)胞線粒體產(chǎn)生影響,我們通過電鏡觀察對照組及43℃熱打擊組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)對照組(37℃)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)基本正常；而熱打擊組(43℃)細(xì)胞線粒體腫脹,其雙層膜和嵴結(jié)構(gòu)消失,線粒體基質(zhì)均質(zhì)化改變(線粒體嵴溶解物、基質(zhì)及含染色質(zhì)物質(zhì)相混合在一起形成致密均質(zhì)團(tuán)塊物),表明高熱對細(xì)胞線粒體具有損傷作用。進(jìn)一步使用Caspase酶活性檢測試劑盒分析凋亡啟動蛋白Caspase-4、8、9的活化及Western Blot檢鋇GADD153、Apaf-1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)熱打擊并沒有激活Caspase-4,8活性及GADD153蛋白的表達(dá),而是特異的激活了Caspase-9及Apaf-1的表達(dá),繼而活化Caspase-3,啟動Caspase的級聯(lián)反應(yīng),引起細(xì)胞凋亡。且Caspase-9及Apaf-11的表達(dá)呈復(fù)溫時間依賴性增強(qiáng),在9h表達(dá)達(dá)到高峰,提示熱打擊可能通過線粒體損傷,激活了內(nèi)源性凋亡通路介導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步證明熱打擊是通過激活內(nèi)源性凋亡介導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡,我們在HUVEC細(xì)胞過表達(dá)Bcl-xl,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bcl-xl后,HUVEC細(xì)胞Caspase-9及Apaf-1表達(dá)明顯減少,并且明顯抑制了Caspase的級聯(lián)反應(yīng),由此確定熱打擊啟動了線粒體損傷相關(guān)的內(nèi)源性凋亡通路。3.熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)介導(dǎo)線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路我們采用Ca2+敏感的熒光染料Flou-3AM,并且結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)分析了HUVEC細(xì)胞熱打擊后不同復(fù)溫時間點(diǎn)(Oh,0.5h、1h、1.5h、2h)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化,結(jié)果顯示：熱打擊后復(fù)溫0h細(xì)胞內(nèi)Ca2+開始升高,2h達(dá)到高峰；同時,激活了下游的線粒體損傷相關(guān)的內(nèi)源性凋亡通路,表現(xiàn)為Caspase-9、Apaf-1的激活及Caspase-3、PARP的活化；進(jìn)一步使用細(xì)胞可滲透的Ca2+螯合劑BAPTA-AM預(yù)處理細(xì)胞30min,熱打擊BAPTA-AM預(yù)處理過HUVEC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM部分抑制了熱打擊誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路,表現(xiàn)為Caspase-9? Apaf-1、Caspase-3和PARP的活化受抑。這一結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)與熱打擊誘導(dǎo)線粒體損傷以及凋亡信號激活相關(guān)。4.熱打擊誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、IP3R磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)提取熱打擊后不同復(fù)溫時間點(diǎn)(0、1、3、6、9h)和37℃對照組HUVEC細(xì)胞總蛋白,Western Blot分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78及未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)相關(guān)蛋白P-PERK、P-eIF2a、ATF4的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),熱打擊Oh時GRP78被激活,持續(xù)到熱打擊后3h左右,其后激活狀態(tài)逐漸被抑制；同樣,熱打擊復(fù)溫0h左右,PERK即被自我磷酸化而激活,隨后被逐漸抑制；eIF2a磷酸化發(fā)生在熱打擊后復(fù)溫1h左右,稍晚于PERK激活,在1h左右達(dá)到高峰,并隨著復(fù)溫時間延長而逐漸下降；ATF4在3h左右表達(dá)增強(qiáng),6h達(dá)高峰,隨后開始被抑制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)的Ca2+儲存器,為了進(jìn)一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)的相關(guān)性,我們檢測了熱打擊后ER膜上三種與Ca2+攝入和釋放相關(guān)的蛋白(IP3R、RYR及SERCA)活化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱打擊后0h即誘導(dǎo)了IP3R磷酸化,并一直持續(xù)到9h,而熱打擊并沒有引起RYR及SERCA蛋白的改變；進(jìn)一步采用IP3R的特異性抑制劑Xestospongin B (XeB)預(yù)處理HUVEC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)XeB可明顯抑制熱打擊后IP3R的磷酸化,同時明顯抑制Ca2+的釋放。由此說明,在熱打擊早期即啟動了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘導(dǎo)UPR信號通路的激活(GRP78、 PERK-eIF2a-ATF4)及IP3R相關(guān)的Ca2+通道的開放,介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn)。5.熱打擊誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性釋放作為上游信號參與Ca2+失穩(wěn)介導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路收集熱打擊后不同復(fù)溫時間點(diǎn)(0h、0.5h、1h,1.5h,2h)和37℃對照組HUVEC細(xì)胞,分別使用熒光探針DHE、DHR和DAF-FMDA標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測熱打擊后02-、H202和NO在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。熱打擊主要誘導(dǎo)了02-和H202兩種自由基的升高,且熱打擊首先引起02-水平的變化,繼而引起H202升高,而對細(xì)胞內(nèi)NO水平?jīng)]有明顯影響。進(jìn)一步采用MnTBAP預(yù)處理HUVEC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)MnTBAP可以明顯減輕熱打擊所致的細(xì)胞毒效應(yīng),提高HUVEC細(xì)胞活力；同時也明顯抑制熱打擊后HUVEC細(xì)胞內(nèi)O2-水平、Ca2+失穩(wěn)、下游線粒體通路的Caspase-9、Apaf-1、Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)以及DNA損傷；然而,當(dāng)我們使用Ca2+特異性清除劑BAPTA-AM預(yù)處理]HUVEC細(xì)胞時,發(fā)現(xiàn)其并不能抑制熱打擊所致的O2-增高,表明在熱打擊引起細(xì)胞凋亡過程中,ROS作為上游產(chǎn)物參與了Ca2+介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路。結(jié)論：熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體損傷,繼而啟動內(nèi)源性凋亡信號介導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡。在這一過程中高熱通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性增加,引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活I(lǐng)P3R相關(guān)Ca2+通道開放,繼而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+失穩(wěn),可能是其重要的上游機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：中暑 熱打擊 凋亡 活性氧 鈣離子 線粒體
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R594.12
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-31
• 材料與方法31-41
• 1. 材料31-32
• 2. 實(shí)驗(yàn)原理及方法32-41
• 結(jié)果41-61
• 1. 熱打擊對細(xì)胞具有直接細(xì)胞毒效應(yīng),誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡及DNA損傷41-45
• 2. 熱打擊誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體損傷,激活內(nèi)源性凋亡通路45-49
• 3. 熱打擊引起細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)失穩(wěn)介導(dǎo)線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路49-55
• 4. 熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性釋放作為上游信號參與Ca~(2+)介導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路55-61
• 討論61-71
• 1. 熱打擊誘導(dǎo)線粒體損傷,激活內(nèi)源性凋亡通路凋亡通路61-65
• 2. 熱打擊引起細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)失穩(wěn)誘導(dǎo)線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路65-68
• 3. 熱打擊誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性釋放作為上游產(chǎn)物參與Ca~(2+)介導(dǎo)的線粒體損傷相關(guān)的凋亡通路68-71
• 參考文獻(xiàn)71-85
• 英文縮略詞表85-86
• 成果·研究生期間論文發(fā)表情況86-88
• 致謝88-90

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 童華生;唐柚青;蘇磊;;腸系膜淋巴在激活重癥中暑血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2012年04期

2 賽燕;死亡底物PARP與細(xì)胞凋亡[J];免疫學(xué)雜志;2002年S1期

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本文編號：926992