發(fā)布時(shí)間：2017-09-18 03:23

  本文關(guān)鍵詞：BBG對大鼠腦創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 創(chuàng)傷性腦損傷 亮藍(lán) 神經(jīng)功能評分 P2X7 PKCγ IL-1β TNF-α 大鼠

【摘要】：目的探討細(xì)胞膜門控離子通道P2X7與腦創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的關(guān)系；應(yīng)用P2X7受體抑制劑BBG進(jìn)行干預(yù)，檢測其對炎性因子IL-1β、TNF-α及PKCγ表達(dá)的影響，探討B(tài)BG的抗炎作用和腦保護(hù)機(jī)制，為腦創(chuàng)傷后的炎性反應(yīng)作為治療靶點(diǎn)的研究開辟新的思路。 方法應(yīng)用120只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組：①Sham組（n=40），②TBI組（n=40）③BBG組（n=40）。各組分為創(chuàng)傷后6h、12h、24h及48h四個時(shí)間點(diǎn)觀察取材。使用Marmarou法建立中度彌漫性TBI模型。對下列指標(biāo)進(jìn)行檢測：①使用HE染色法觀察，腦組織海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)變化；②使用干濕比重法檢測各組的腦組織水腫程度；③激光共聚焦法檢測PKCγ的表達(dá)定位情況；④Western-blot法檢測PKCγ、IL-1β、TNF-α和P2X7的蛋白表達(dá)量。⑤另取32只大鼠在創(chuàng)傷后7-11天行Morris水迷宮測試，對其空間學(xué)習(xí)和記憶能力進(jìn)行檢測。應(yīng)用Gel-Doc軟件分析系統(tǒng)對部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行量化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件，使用重復(fù)的單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1HE染色結(jié)果：Sham組海馬區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、數(shù)目較多、排列規(guī)則。TBI組織疏松，明顯水腫，微血管周圍間隙和細(xì)胞周圍間隙顯著增寬；海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞、排列不規(guī)律、數(shù)量顯著減少，胞漿嗜色性明顯減弱，核固縮，部分核仁消失。BBG組病理學(xué)改變?nèi)匀幻黠@，但是與TBI組比較，水腫有所減輕，微血管及細(xì)胞周圍間隙的增寬程度減��；海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對較完整，胞核固縮較TBI組有所減輕。2大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)果：與Sham組比較，TBI組大鼠平均逃避潛伏期顯著增長（P＜0.05）。與TBI組比較，BBG組在9、10天平均逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），，但仍然長于sham組。在創(chuàng)傷后11天的空間搜索實(shí)驗(yàn)過程中，與Sham組相比，TBI組穿越平臺次數(shù)、平臺所在象限路程比及時(shí)間比均顯著減少（P＜0.05）；與TBI組相比，BBG治療組穿越平臺次數(shù)和2個比值均顯著增加（P＜0.05）。3腦水腫的測定：Sham組在各個時(shí)間點(diǎn)的腦組織水含量未見差異。TBI組的腦組織水含量隨創(chuàng)傷后時(shí)間延長逐漸升高，在3h、6h、12h、24h均顯著高于sham組。BBG治療組3-24h的含水量顯著低于TBI組（P＜0.05），但仍略高于sham組。4P2X7的Western blot檢測結(jié)果：sham組P2X7有很弱的基礎(chǔ)表達(dá)且各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)無明顯差異。TBI組與sham組對比，6h時(shí)P2X7表達(dá)開始升高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），24h開始回落，至48h逐漸減弱但仍高于sham組（P＜0.05）。BBG組P2X7表達(dá)強(qiáng)度和時(shí)間變化趨勢與TBI組類似，但在創(chuàng)傷后6-48h的表達(dá)量仍然高于sham組（P＜0.05）。5PKCγ的Western blot檢測結(jié)果：Sham組：平均光密度分析發(fā)現(xiàn)僅有少量PKCγ表達(dá)，其表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無差異。TBI組：PKCγ蛋白量與Sham組比較，傷后6h增高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），持續(xù)高表達(dá)至創(chuàng)傷后24h（P＜0.05），創(chuàng)傷48h后PKCγ蛋白表達(dá)有所下降，但仍顯著高于Sham組（P＜0.05）。BBG組：PKCγ蛋白表達(dá)與時(shí)間的對應(yīng)關(guān)系和TBI組類似，但表達(dá)量顯著低于TBI組，其在傷后6-48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6IL-1β的Western blot檢測結(jié)果: Sham組僅有少量IL-1β表達(dá)，其表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無差異。TBI組與Sham組比較，傷后6h增高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），持續(xù)高表達(dá)至創(chuàng)傷后24h（P＜0.05），創(chuàng)傷48h后IL-1β蛋白表達(dá)有所下降，但仍顯著高于Sham組（P＜0.05）。BBG組IL-1β蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化的趨勢與TBI組類似，其表達(dá)量略低于TBI組，在傷后24h和48h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。7PKCγ與NeuN的共聚焦檢測結(jié)果：FITC標(biāo)記的綠色熒光顯示PKCγ的表達(dá)，TRITC標(biāo)記的紅色熒光顯示神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN的表達(dá)。在TBI后24h，NeuN（紅色）與PKCγ（綠色）在海馬區(qū)存在共定位。8TNF-α western blot檢測結(jié)果：Sham組TNF-α蛋白表達(dá)量的比值在各時(shí)間點(diǎn)無變化。TBI組與Sham組比，在傷后6h開始升高（P＜0.05），12h達(dá)到高峰（P＜0.05），24-48h有所下降，但仍高于Sham組（P＜0.05）。BBG治療組TNF-α顯著低于TBI組，在傷后6-12h的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論BBG對大鼠腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損害具有保護(hù)作用，其機(jī)制之一是通過抑制P2X7的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性因子IL-1β、TNF-α以及蛋白激酶PKCγ的表達(dá)，從而減輕腦水腫和腦組織損傷程度，保護(hù)神經(jīng)元，改善神經(jīng)功能狀態(tài)和記憶學(xué)習(xí)能力。通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，為改善腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元功能狀態(tài)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有可能成為一個新的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)傷性腦損傷 亮藍(lán) 神經(jīng)功能評分 P2X7 PKCγ IL-1β TNF-α 大鼠
【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-44
• 1.1 材料與方法13-17
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物13
• 1.1.2 主要試劑13-14
• 1.1.3 主要設(shè)備及儀器14-15
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)所需溶液及其配制15-17
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方法17
• 1.2.2 大鼠 Marmarou’s 中度彌漫性腦創(chuàng)傷模型制備17-18
• 1.2.3 腦組織內(nèi)含水量的測量18
• 1.2.4 空間學(xué)習(xí)記憶功能測試18
• 1.2.5 組織學(xué)標(biāo)本的制備及相應(yīng)染色方法18-22
• 1.2.6 Western blot 平均光密度（OD）測定及結(jié)果判定22
• 1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理22
• 1.3 結(jié)果22-33
• 1.3.1 彌漫性腦創(chuàng)傷模型的制備評價(jià)22-23
• 1.3.2 HE 染色結(jié)果23
• 1.3.3 大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)果23-26
• 1.3.4 腦組織水含量測定26-27
• 1.3.5 P2X7 的 Western blot 檢測結(jié)果27-29
• 1.3.6 IL-1β與 TNF-α的 Western blot 檢測結(jié)果29-31
• 1.3.7 PKCγ western blot 檢測結(jié)果31-33
• 1.3.8 PKCγ與 NeuN 的激光共聚焦檢測結(jié)果33
• 1.4 討論33-38
• 1.4.1 大鼠 Marmarou 中度彌漫性腦創(chuàng)傷模型制作及效果評價(jià)33-34
• 1.4.2 小膠質(zhì)細(xì)胞在炎性反應(yīng)中的作用34-35
• 1.4.3 TBI 啟動了 P2X7 介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活加重了創(chuàng)傷后的繼發(fā)性損傷35-36
• 1.4.4 BBG 通過抑制 P2X7R 的激活發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用36-37
• 1.4.5 彌漫性腦創(chuàng)傷后給予 BBG 干預(yù)后下調(diào) PKCγ改善了大鼠的神經(jīng)功能障礙37-38
• 1.5 結(jié)論38
• 參考文獻(xiàn)38-44
• 第2章 綜述 小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用44-56
• 2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞在炎性反應(yīng)中的作用44-47
• 2.1.1 促炎性因子45
• 2.1.2 氧自由基（ROS）45-46
• 2.1.3 環(huán)氧化酶 2（COX-2）46
• 2.1.4 抗炎性細(xì)胞的介質(zhì)46-47
• 2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)變性型疾病中所起到的作用47-49
• 2.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞與阿爾茨海默病47
• 2.2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞與帕金森病47-48
• 2.2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞與亨廷頓病48
• 2.2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞與多發(fā)性硬化病48
• 2.2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞與萎縮性肌肉側(cè)索硬化癥48-49
• 2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞與嘌呤受體49-51
• 2.3.1 P2Y 受體49
• 2.3.2 P2X 受體49-51
• 2.3.3 小膠質(zhì)細(xì)胞與嘌呤受體51
• 2.4 小結(jié)與展望51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 附錄56-57
• 致謝57-58
• 導(dǎo)師簡介58-59
• 作者簡介59-60
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集60

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本文編號：873107