發(fā)布時(shí)間：2017-09-07 22:54

  本文關(guān)鍵詞：亞低溫對(duì)顱腦創(chuàng)傷微環(huán)境下溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化特性影響的研究

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【摘要】：目的:從物理和化學(xué)微環(huán)境的角度探討亞低溫對(duì)顱腦損傷(TBI)后移植溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(ts UC)分化特性的影響。方法:1溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的建立、培養(yǎng):從新生兒臍帶中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC);通過(guò)感染攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)制備ts UC,并于正常培養(yǎng)溫度(NT,37℃)和亞低溫(MHT,33℃)條件下分別培養(yǎng)。2模擬腦組織彈性模量制備二維培養(yǎng)基質(zhì):利用單丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合作用,按不同濃度配比制備出不同彈性模量的聚丙烯酰胺(PA)水凝膠;應(yīng)用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)拉伸檢測(cè)水凝膠的彈性,并篩選出類(lèi)似于腦組織和顱腦損傷后腦組織(近似于肌肉組織)彈性模量的聚丙烯酰胺水凝膠;按相應(yīng)的濃度配比,制備模擬腦組織和肌肉組織彈性模量的二維培養(yǎng)基質(zhì)。3亞低溫(MHT)對(duì)正常腦組織及TBI腦組織物理微環(huán)境下ts UC的影響:實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組(Sham組)、UC+NT+0.5k Pa組、ts UC+MHT+0.5k Pa組、UC+NT+8.0k Pa組、ts UC+MHT+8.0k Pa組。其中Sham組為玻片上常規(guī)培養(yǎng)UC,其余4組分別按細(xì)胞種類(lèi)、培養(yǎng)基彈性模量及培養(yǎng)溫度區(qū)分。動(dòng)態(tài)觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化,7天后行免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞的分化水平,對(duì)于分化的神經(jīng)元用Image J軟件計(jì)算其軸突長(zhǎng)度。4亞低溫后TBI腦組織化學(xué)微環(huán)境對(duì)UC的影響:應(yīng)用電子腦皮質(zhì)挫傷撞擊儀制作大鼠TBI模型,給予全身亞低溫處理4 h后,獲取大鼠模型損傷區(qū)域腦組織的提取液,同樣獲得單純TBI及假手術(shù)組大鼠的腦組織提取液。模擬腦組織彈性模量制備聚丙烯酰胺水凝膠,將分離培養(yǎng)的UC置于上述水凝膠上培養(yǎng),分別加入三種大鼠的腦組織勻漿液,由此分為UC+Sham、UC+TBI、UC+TBI+MHT三組,24 h后檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平,并更換為UC的正常培養(yǎng)基。7天后行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)其向神經(jīng)元分化的水平。5亞低溫聯(lián)合ts UC移植對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能的修復(fù):將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、注射PBS組(TBI+PBS組)、溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(TBI+ts UC組)、亞低溫+溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(TBI+MHT+ts UC組),除Sham組和TBI+PBS組外,均采用立體定向技術(shù)將預(yù)先行Brd U標(biāo)記的干細(xì)胞注射到損傷處腦組織周?chē)?TBI+PBS組注射等量PBS),其中TBI+MHT+ts UC組的大鼠在造模完成后立即行亞低溫治療,待體溫降至33℃后行干細(xì)胞移植。傷后第3天采用干濕比重法測(cè)定腦組織含水量,傷后24小時(shí)、3天、7天分別行神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分,7天后腦組織取材測(cè)定損傷體積,并行細(xì)胞免疫熒光評(píng)價(jià)移植干細(xì)胞的存活情況。結(jié)果:1 UC和ts UC的培養(yǎng)和鑒定結(jié)果:UC的流式細(xì)胞分析檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞表面抗原的表達(dá)符合UC的特征,UC細(xì)胞的純度為97.91%,生長(zhǎng)、增殖活性較強(qiáng)。經(jīng)轉(zhuǎn)染攜ts-SV40LT基因慢病毒的UC,其生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞蛋白表達(dá)均符合ts UC的特性。2以PA水凝膠為基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì):通過(guò)力學(xué)試驗(yàn)機(jī)的測(cè)量及篩檢,最終得到彈性模量近似于腦組織和顱腦損傷后腦組織的PA水凝膠彈性模量檢測(cè)結(jié)果,分別為0.5±0.03 k Pa和8.0±0.11 k Pa。按相應(yīng)比例于蓋玻片上配制出相應(yīng)彈性模量的培養(yǎng)基。3不同彈性模量水凝膠上干細(xì)胞的形態(tài)變化:相差顯微鏡下顯示,UC+NT+0.5k Pa組、ts UC+MHT+0.5k Pa組部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的胞突,形態(tài)上類(lèi)似于神經(jīng)元;而UC+NT+8.0k Pa組、ts UC+MHT+8.0k Pa組部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng),類(lèi)似于肌細(xì)胞;Sham組細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)變化。4不同彈性模量水凝膠上干細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果:細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,僅UC+NT+0.5k Pa組、ts UC+MHT+0.5k Pa組有少量神經(jīng)元陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞,與其余3組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.01);而UC+NT+0.5k Pa組、ts UC+MHT+0.5k Pa二者相比,神經(jīng)元分化率及神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度均無(wú)明顯差異(#P0.05)。5不同腦組織提取物干預(yù)作用下干細(xì)胞的凋亡水平和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果:與UC+Sham組相比,24 h后UC+TBI組的凋亡細(xì)胞明顯增多(*P0.01),而UC+TBI+MHT組可顯著逆轉(zhuǎn)TBI組誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞增多,二組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.01);7天后的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,與UC+TBI組相比,UC+TBI+MHT組UC的神經(jīng)元分化率亦明顯增高(*P0.01)。6大鼠腦水腫程度與神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分:傷后第3天,TBI+ts UC+MHT組大鼠的腦組織水腫程度明顯降低,與TBI+PBS組、TBI+ts UC組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,#P0.05);傷后3天,TBI+PBS組、TBI+ts UC組和TBI+ts UC+MHT組大鼠神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分較第1天相應(yīng)降低(aP0.05),傷后7天,TBI+PBS組、TBI+ts UC組和TBI+ts UC+MHT組大鼠神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分較第3天相應(yīng)降低(bP0.05);傷后3天、7天,TBI+ts UC+MHT組大鼠的神經(jīng)學(xué)缺損評(píng)分明顯較低,與TBI+PBS組和TBI+ts UC組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(cP0.05,dP0.05)。7大鼠腦組織損傷體積測(cè)定結(jié)果:TBI+ts UC+MHT組大鼠的腦組織損傷體積明顯小于TBI+PBS組、TBI+ts UC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,#P0.05)。8大鼠腦組織移植細(xì)胞存活及增殖情況:免疫熒光結(jié)果顯示,TBI+ts UC+MHT組移植干細(xì)胞的存活量明顯多于TBI+ts UC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。結(jié)論:1亞低溫聯(lián)合ts UC與常溫下UC的分化能力相似,在模擬腦組織彈性模量的培養(yǎng)基中均可向神經(jīng)元分化,而在模擬TBI腦組織彈性模量的培養(yǎng)基中則無(wú)分化為神經(jīng)元的能力。2亞低溫可改善TBI腦組織的高張物理微環(huán)境,從而提高移植ts UC的存活與分化能力,并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。3亞低溫治療可改善損傷后的腦組織的化學(xué)微環(huán)境,減少移植UC的凋亡,并使其分化能力得到一定恢復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：亞低溫 顱腦損創(chuàng)傷 物理微環(huán)境 化學(xué)微環(huán)境 溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 彈性模量 腦組織提取液
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文縮寫(xiě)12-13
• 前言13
• 材料與方法13-29
• 結(jié)果29-32
• 附圖32-43
• 附表43-45
• 討論45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述 基于生物力學(xué)的干細(xì)胞調(diào)控及相關(guān)物理性質(zhì)的測(cè)定52-60
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 致謝60-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 李曉紅;陳，

本文編號(hào)：810376