本文關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膿毒癥后期免疫抑制形成中的調(diào)控作用研究

  更多相關(guān)文章： 膿毒癥 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 二次感染 T細(xì)胞 自然殺傷細(xì)胞

【摘要】：膿毒癥(Sepsis)是由嚴(yán)重感染或創(chuàng)傷誘發(fā)機(jī)體炎癥調(diào)控機(jī)制失控所導(dǎo)致的臨床綜合征,是重癥感染患者和動(dòng)物死亡的主要原因之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥免疫抑制時(shí)期患者死亡人數(shù)常常超過膿毒癥急性炎癥階段患者死亡數(shù)。而與免疫抑制相關(guān)的免疫病理學(xué)改變則被認(rèn)為是導(dǎo)致大多數(shù)從最初的過度炎癥中存活下來的病患在后期死亡的主要原因。本研究通過注射內(nèi)毒素建立膿毒癥免疫抑制小鼠模型,檢測(cè)此模型小鼠在細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)注射后不同時(shí)間機(jī)體的免疫狀態(tài),確定LPS注射后引起嚴(yán)重免疫抑制的時(shí)間,在此基礎(chǔ)上研究膿毒癥后期小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在免疫抑制中形成的作用和調(diào)控Tregs水平對(duì)膿毒癥小鼠盲腸結(jié)扎穿刺(Cecal ligation-perforation,CLP)誘導(dǎo)的慢性或急性腹膜炎死亡率的影響。研究取得如下結(jié)果:1.LPS注射誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠具有典型的膿毒癥免疫學(xué)特征通過不同劑量的LPS尾靜脈注射誘導(dǎo)膿毒癥小鼠模型。結(jié)果顯示:注射劑量為1.25mg/kg體重的LPS可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生典型的膿毒癥臨床病變特征,并在膿毒癥后期誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制。與注射1.25 mg/kg的小鼠相比,注射劑量為5 mg/kg LPS的小鼠可以表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的臨床癥狀和較長(zhǎng)時(shí)間的恢復(fù)期,同時(shí)并不引起小鼠死亡。以注射5 mg/kg LPS的小鼠作為膿毒癥動(dòng)物模型,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液中關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子的變化,結(jié)果顯示,在LPS注射后早期(1~12 h),LPS膿毒癥小鼠體內(nèi)IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10均顯著升高,在LPS注射后24 h,這些細(xì)胞因子均顯著下降;動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)脾臟和血液中淋巴細(xì)胞的變化,結(jié)果顯示,在LPS注射后24 h,脾臟和血液中T細(xì)胞、B細(xì)胞以及NK細(xì)胞數(shù)目均顯著下降;在LPS注射后24 h的膿毒癥小鼠,給予腹腔細(xì)菌感染,感染后1h和3h,血清中細(xì)胞因子IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-10水平顯著低于生理鹽水對(duì)照組小鼠腹腔感染后血液中細(xì)胞因子水平,并且膿毒癥小鼠對(duì)感染的清除能力也顯著低于對(duì)照組小鼠。以上結(jié)果表明,5 mg/kg LPS注射可誘導(dǎo)典型的LPS膿毒癥小鼠模型,在LPS注射后24h,小鼠免疫狀態(tài)表現(xiàn)為典型的免疫抑制或免疫麻痹。2.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在促進(jìn)膿毒癥后期免疫抑制的形成中發(fā)揮重要作用利用CD25抗體注射去除LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠體內(nèi)的Tregs細(xì)胞,檢測(cè)Tregs細(xì)胞去除對(duì)膿毒癥后期免疫抑制形成的影響。結(jié)果顯示,與同型對(duì)照組LPS膿毒癥小鼠相比,Tregs去除的LPS膿毒癥小鼠,脾臟中的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞比例顯著增加;CD69陽(yáng)性的CD4與CD8 T細(xì)胞和CD69陽(yáng)性的NK細(xì)胞比例顯著增加;與同型對(duì)照組小鼠相比較,Tregs去除的小鼠在LPS作用24 h后,取脾臟淋巴細(xì)胞體外給予IL-12刺激,IFN-γ陽(yáng)性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例顯著增加。以上結(jié)果說明,Tregs的去除可以明顯逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞比例下降,并且提高LPS膿毒癥小鼠后期T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性和反應(yīng)性。3.降低膿毒癥形成過程中Tregs細(xì)胞水平可有效地提高小鼠二次慢性感染后的抵抗能力小鼠在LPS作用24 h后用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)方式制造慢性腹膜炎。CLP二次打擊72h后,發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠腹腔、血液和肺中的細(xì)菌數(shù)目與對(duì)照小鼠相比,高出兩個(gè)數(shù)量級(jí);Tregs去除的膿毒癥小鼠經(jīng)CLP二次打擊后,腹腔、血液和肺中的細(xì)菌數(shù)目明顯減少。在CLP 14天后,同型對(duì)照抗體處理的膿毒癥小鼠存活率約為40%,而Tregs去除抗體處理的膿毒癥小鼠存活率為70%以上,提高了約30%。以上結(jié)果表明,Tregs細(xì)胞的去除增加了膿毒癥小鼠對(duì)后續(xù)慢性感染的抵抗力從而提高了LPS膿毒癥小鼠在二次慢性感染中的存活率。4.去除膿毒癥小鼠的Tregs細(xì)胞增加二次亞急性感染的敏感性和早期致死率LPS小鼠給予Tregs去除抗體后或者同型對(duì)照抗體之后,用CLP方式制造亞急性腹膜炎。Tregs去除小鼠與同型對(duì)照小鼠相比在二次亞急性感染早期表現(xiàn)出顯著降低的存活率。以上結(jié)果表明,Tregs的去除會(huì)導(dǎo)致小鼠對(duì)二次感染的敏感性上升,從而增加了后續(xù)嚴(yán)重感染下的早期死亡率。本研究建立了LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型,利用細(xì)菌感染以及CLP作為膿毒癥免疫抑制期二次感染的方式,研究Tregs在膿毒癥后期免疫抑制形成中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)體內(nèi)Tregs的數(shù)目能夠在一定程度上抑制或者阻止膿毒癥后期免疫抑制表型的形成,提高膿毒癥后期小鼠的免疫反應(yīng)性和抗感染能力,繼而提高二次慢性感染中小鼠的存活率,但是卻會(huì)增加二次亞急性早期的死亡率。本研究工作為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Tregs在重癥感染性膿毒癥形成中的調(diào)控作用和機(jī)制提供了理論支持,為探索以通過調(diào)節(jié)Tregs來改善機(jī)體免疫狀態(tài)為導(dǎo)向的免疫調(diào)控治療方法提供了理論指導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 二次感染 T細(xì)胞 自然殺傷細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 文獻(xiàn)綜述14-22
• 第一章 膿毒癥的研究概況及常見動(dòng)物模型14-18
• 1.1 膿毒癥的研究意義14
• 1.2 膿毒癥的研究現(xiàn)狀14-15
• 1.2.1 膿毒癥的發(fā)病機(jī)制14-15
• 1.3 常見的膿毒癥動(dòng)物模型15-18
• 1.3.1 細(xì)菌或內(nèi)毒素攻擊模型16
• 1.3.2 CLP模型16
• 1.3.3 CASP模型16-18
• 第二章 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究現(xiàn)狀18-22
• 2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能特性18
• 2.2 影響Tregs發(fā)育及功能的因素18-20
• 2.2.1 胸腺選擇對(duì)Tregs的影響18-19
• 2.2.2 抗原因素誘導(dǎo)Tregs生成19
• 2.2.3 樹突狀細(xì)胞影響Tregs生成19
• 2.2.4 細(xì)胞因子維持Tregs發(fā)育及存活19
• 2.2.5 叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）19-20
• 2.3 CD4~+ CD25~+ Tregs的作用機(jī)制20
• 2.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膿毒癥中的研究進(jìn)展20-21
• 2.5 結(jié)語(yǔ)21
• 2.6 本研究的目的和意義21-22
• 試驗(yàn)研究22-43
• 第三章 LPS膿毒癥小鼠模型的建立22-33
• 3.1 材料22-23
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22-23
• 3.1.2 主要試劑23
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備23
• 3.2 方法23-25
• 3.2.1 動(dòng)物分組23
• 3.2.2 體內(nèi)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的制備23-24
• 3.2.3 膿毒癥小鼠免疫抑制程度的檢測(cè)24
• 3.2.4 膿毒癥小鼠血清細(xì)胞因子的檢測(cè)24
• 3.2.5 脾臟淋巴細(xì)胞懸浮液的制備24
• 3.2.6 脾臟淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)24-25
• 3.2.7 細(xì)菌清除率25
• 3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25
• 3.3 結(jié)果25-32
• 3.3.1 不同劑量LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的生命體征變化25-26
• 3.3.2 不同劑量LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠腹腔注射致死量大腸桿菌后的存活情況26-27
• 3.3.3 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠炎性細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化27-28
• 3.3.4 膿毒癥過程中脾臟和外周血淋巴細(xì)胞數(shù)目的變化情況28-30
• 3.3.5 膿毒癥后期小鼠的免疫反應(yīng)能力和抗感染能力30-32
• 3.4 討論32
• 3.5 小結(jié)32-33
• 第四章 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膿毒癥后期免疫抑制形成中的作用33-43
• 4.1 材料33-34
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 4.1.2 主要試劑33-34
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備34
• 4.2 方法34-35
• 4.2.1 雙重打擊膿毒癥小鼠模型的建立34
• 4.2.2 體內(nèi)Tregs去除34
• 4.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞比例和細(xì)胞因子34-35
• 4.2.4 細(xì)菌清除率35
• 4.2.5 統(tǒng)計(jì)35
• 4.3 結(jié)果35-40
• 4.3.1 CLP模型存活情況統(tǒng)計(jì)35-36
• 4.3.2 LPS誘導(dǎo)的膿毒癥發(fā)展過程中Tregs的變化36
• 4.3.3 Tregs去除后對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠淋巴細(xì)胞變化的影響36-37
• 4.3.4 Tregs去除對(duì)膿毒癥后期淋巴細(xì)胞活性的影響37-39
• 4.3.5 Tregs去除對(duì)膿毒癥小鼠抵抗感染能力的影響39-40
• 4.4 討論40-41
• 4.5 小結(jié)41-43
• 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 主要縮略詞和中英文對(duì)照表49-50
• 附錄50-53
• 致謝53-55
• 作者簡(jiǎn)介55

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本文編號(hào)：809742