本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細胞的DNA甲基化調(diào)控機制

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【摘要】：目的:(1)優(yōu)化人外分泌汗腺細胞(sweat gland cells,SGCs)的分離方法,以高效地獲取原代汗腺細胞。(2)建立體外誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)向汗腺樣細胞分化的共培養(yǎng)體系,并觀察誘導后細胞形態(tài)、表型和相關(guān)基因表達的改變。(3)探討DNA甲基化在BM-MSCs向汗腺樣細胞轉(zhuǎn)分化過程中的調(diào)控作用,并尋找甲基化調(diào)控的靶點基因。方法:(1)取新鮮的全皮層組織,剪成小塊微粒,分別用不同的方法(胰酶+膠原酶,單純胰酶,單純膠原酶)消化分離汗腺,觀察消化過程中出現(xiàn)游離汗腺的時間;微量移液器挑取游離汗腺,進行體外培養(yǎng),觀察細胞的貼壁情況和生長狀態(tài);9天后,流式細胞儀檢測存活下來的細胞的增殖能力,并利用免疫細胞化學檢測汗腺細胞的表面抗原CK7和CEA的表達狀況。(2)購買骨髓間充質(zhì)干細胞系,體外培養(yǎng)、擴增,并進行細胞的成脂肪、成骨細胞分化能力的鑒定;選取第三代的BM-MSCs與熱休克后汗腺細胞(47℃)進行Transwell+誘導因子的共培養(yǎng),分別于第3、6、9天觀察細胞形態(tài)學的變化,設(shè)置汗腺細胞為陽性對照組。細胞免疫熒光技術(shù)檢測細胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表達,RT-PCR和Western blot分別檢測CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表達變化。(3)采用Illumina 450K甲基化芯片檢測轉(zhuǎn)分化前后細胞的甲基化水平的變化,篩選甲基化差異性基因,隨后對差異基因進行生物信息學分析(差異位點篩選、聚類層次分析、Gene Ontology、KEGG Pathway分析、生物學功能注釋、蛋白-蛋白相互作用);結(jié)合預實驗結(jié)果和相關(guān)文獻,對若干候選基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等),用甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)進行初步驗證,然后通過Mass Array飛行質(zhì)譜技術(shù)對特定基因位點進行重點分析;最后,構(gòu)建特定基因的重組質(zhì)粒,體外轉(zhuǎn)染BM-MSCs,觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞表型和相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果:(1)酶聯(lián)合消化法(a組)在2h時,鏡下可見較多游離的汗腺細胞;胰蛋白酶-edta法(c組)獲取的細胞貼壁很差;膠原酶法(b組)在6h左右時,才有較多的游離汗腺出現(xiàn)。a組和b組獲取后的汗腺細胞貼壁良好,生長增殖正常,流式檢測結(jié)果顯示:a組和b組細胞的增殖指數(shù)分別為(18±4)%和(17±6)%,無統(tǒng)計學差異。免疫細胞化學表型鑒定結(jié)果顯示:酶聯(lián)合消化組和膠原酶組獲取的細胞cea、ck7陽性率未見明顯差異。(2)通過多向分化潛能實驗,我們證實bm-mscs可以分化為脂肪細胞和骨細胞。transwell+誘導因子共培養(yǎng)3天時,bm-mscs的細胞形態(tài)基本沒有變化,仍呈長梭形;共培養(yǎng)9d后,細胞形態(tài)呈多樣化,部分細胞出現(xiàn)近似于汗腺樣細胞的改變,由誘導前的長梭形變?yōu)楸馄讲灰?guī)則狀,并且逐步聚集呈向心性生長。對汗腺樣細胞進行細胞免疫熒光、rt-pcr和westernblot檢測,都發(fā)現(xiàn)其不同程度地表達汗腺細胞表面抗原ck7、cea。(3)采用illumina甲基化芯片,在全基因組范圍內(nèi)初步篩選出甲基化水平明顯差異的探針位點693個;甲基化差異性基因有437個基因(升高97個,下降350個);差異位點區(qū)域分布顯示:主要分布在n_shore和cpgislands區(qū)域,基因區(qū)域分布主要集中在genebody和tss200區(qū)域。geneontology和keggpathway分析顯示:主要涉及細胞命運界定、信號轉(zhuǎn)導與基因表達、轉(zhuǎn)錄阻遏、外胚層發(fā)育等生物學過程。msp和massarray飛行質(zhì)譜結(jié)果顯示:與誘導前bm-msc相比,誘導后汗腺樣細胞中hdac4的甲基化水平明顯下調(diào),與甲基化芯片結(jié)果大體一致。轉(zhuǎn)染hdac4質(zhì)粒載體后,免疫細胞化學和rt-pcr結(jié)果都顯示cea表達明顯上調(diào)。結(jié)論:(1)胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合應(yīng)用能明顯縮短汗腺細胞的分離時間,且不影響細胞的增殖活性和抗原表達情況。(2)bm-mscs和熱休克汗腺間接共培養(yǎng)體系(transwell+誘導因子)提供了適宜轉(zhuǎn)分化的微環(huán)境,并且通過該方法成功的獲得了汗腺樣細胞。(3)作為表觀遺傳修飾的重要方式—dna甲基化,參與并影響著bm-mscs向汗腺樣細胞轉(zhuǎn)分化的過程。(4)HDAC4可能是對CEA選擇性的入核轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控,表現(xiàn)在轉(zhuǎn)染HDAC4質(zhì)粒后,CEA表達上調(diào),進而影響著轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細胞的生物學過程。
【關(guān)鍵詞】：汗腺細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞 DNA 甲基化 表觀遺傳學
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R644
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、優(yōu)化人外分泌汗腺細胞的分離方法17-26
• 1.1 對象和方法17-22
• 1.1.1 主要試劑17-18
• 1.1.2 主要儀器18-19
• 1.1.3 主要試劑配制19-20
• 1.1.4 標本取材及處理20
• 1.1.5 檢測指標與方法20-22
• 1.1.6 統(tǒng)計學分析22
• 1.2 結(jié)果22-24
• 1.2.1 不同消化方法分離汗腺的結(jié)果22
• 1.2.2 汗腺細胞的生長狀態(tài)和生長活性觀察22-23
• 1.2.3 汗腺細胞的增殖指數(shù)測定結(jié)果23
• 1.2.4 汗腺細胞表型的鑒定結(jié)果23-24
• 1.3 討論24-25
• 1.4 小結(jié)25-26
• 二、建立hBM-MSC與汗腺細胞共培養(yǎng)誘導體系26-45
• 2.1 對象和方法26-38
• 2.1.1 主要試劑26-29
• 2.1.2 主要儀器29
• 2.1.3 主要試劑配制29-32
• 2.1.4 BM-MSC復蘇、培養(yǎng)32
• 2.1.5 BM-MSC形態(tài)、表型、多向分化能力的鑒定32-34
• 2.1.6 BM-MSC與汗腺細胞共培養(yǎng)實驗34
• 2.1.7 汗腺樣細胞的檢測指標與鑒定34-38
• 2.1.8 統(tǒng)計學分析38
• 2.2 結(jié)果38-43
• 2.2.1 BM-MSCs形態(tài)、表型、多向分化能力的鑒定38-40
• 2.2.2 誘導前后細胞形態(tài)、表型及相關(guān)基因變化40-43
• 2.3 討論43-44
• 2.4 小結(jié)44-45
• 三、BM-MSC轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細胞過程中DNA甲基化的研究45-64
• 3.1 對象和方法45-50
• 3.1.1 主要儀器與軟件45
• 3.1.2 主要材料與試劑45-46
• 3.1.3 Illumina 450K甲基化芯片46-47
• 3.1.4 DNA甲基化相關(guān)的生物信息學分析47-49
• 3.1.5 甲基化芯片數(shù)據(jù)的驗證49-50
• 3.1.6 HDAC4質(zhì)粒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染BM-MSCs50
• 3.2 結(jié)果50-61
• 3.2.1 DNA甲基化相關(guān)的生物信息學分析50-58
• 3.2.2 MSP和Mass Array對芯片結(jié)果的驗證58-60
• 3.2.3 HDAC4表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因的變化60-61
• 3.3 討論61-62
• 3.4 小結(jié)62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-69
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明69-71
• 綜述 DNA甲基化對干細胞分化的影響及其作用方式71-80
• 綜述參考文獻75-80
• 致謝80

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳曉鵬;劉志強;周春燕;;基因組DNA甲基化修飾在胚胎干細胞分化過程中的作用[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2007年06期

2 ;The genomic landscapes of histone H3-Lys9 modifications of gene promoter regions and expression profiles in human bone marrow mesenchymal stem cells[J];遺傳學報;2008年10期

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本文編號：784367