本文關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞抑制燒傷創(chuàng)面內(nèi)殘存角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的實驗研究

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【摘要】：研究意義 隨著社會的進(jìn)步和醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，加之人們美學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的相應(yīng)提高，在救治燒（燙）傷患者生命的同時，對燒傷創(chuàng)面的治療與處理的標(biāo)準(zhǔn)也不斷提高。因此，在燒傷早期對燒傷創(chuàng)面及時正確的處理顯得尤為重要。創(chuàng)面的修復(fù)主要是由創(chuàng)面內(nèi)或局部的角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocytes，KCs）、成纖維細(xì)胞及相應(yīng)的細(xì)胞或組織因子之間的相互作用來完成的，其最終結(jié)局為損傷部位的再上皮化。在這一過程中角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）的作用顯得尤為重要，創(chuàng)面內(nèi)或局部缺乏角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）或者角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）活性不佳往往會造成創(chuàng)面延遲愈合甚至無法愈合。燒傷往往會造成創(chuàng)面中角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）凋亡、壞死，而在燒傷早期創(chuàng)面中殘存少量的KCs和其他細(xì)胞，而這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸在一定程度上決定了燒傷創(chuàng)面的預(yù)后。 間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）為一種來源于組織間質(zhì)的成體干細(xì)胞，MSCs不僅具有干細(xì)胞相關(guān)的自我更新、多向分化轉(zhuǎn)分化的潛能，而且還具有較強的旁分泌及免疫調(diào)節(jié)功能，同時其在促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和改善組織損傷方面作用明顯。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）為一類來源于脂肪間質(zhì)的MSCs，其具有MSCs的相關(guān)特性。因此本研究擬在燒傷早期通過利用ADSCs的相關(guān)特性對燒創(chuàng)面進(jìn)行干預(yù)，檢測其對熱損傷引起的KCs凋亡的影響，并初步探討ADSCs可能相關(guān)的作用機制，，進(jìn)而為日后采用ADSCs進(jìn)行創(chuàng)面治療提供一定的理論依據(jù)。 研究方法 1.取健康雌性BALB/c小鼠5只，采用膠原酶消化法分離純化脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）。取第3代細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，采用流式細(xì)胞儀檢測間充質(zhì)干細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)記物CD31、CD34、CD45、CD90、CD105；并行成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定。 2.取雌性新生3d BALB/c子鼠3只，采用胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞（KCs）；常規(guī)復(fù)蘇人角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT細(xì)胞）；利用51.5℃的恒溫水浴中孵育上述細(xì)胞35s建立KCs的熱損傷模型；吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色后檢測KCs熱損傷模型的凋亡情況；流式細(xì)胞儀檢測熱損傷后即刻凋亡率。 3. HaCaT細(xì)胞以0.9%NaCl饑餓孵育24h后隨機分為對照組和實驗組，分別以無血清DMEM和體積分?jǐn)?shù)100%ADSCs-CM分別培養(yǎng)12h后，采用AO/EB法檢測2組細(xì)胞的凋亡情況；HaCaT細(xì)胞熱損傷后按隨機數(shù)表法分為常規(guī)培養(yǎng)組、無血清培養(yǎng)組、50%ADSCs-CM組、100%ADSCs-CM組，分別以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液、無血清DMEM培養(yǎng)液、含體積分?jǐn)?shù)50%ADSCs-CM的DMEM培養(yǎng)液（無血清DMEM: ADSCs-CM=1:1）、體積分?jǐn)?shù)100%ADSCs-CM常規(guī)培養(yǎng)；于處理后3h、6h、12h、24h采用AO/EB染色法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況；處理12h后，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期分布；Real-time PCR和Western-blot檢測Bcl-2、Caspase-3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 4.健康雌性BALB/c小鼠20只，背部脫毛后隨機分為假燙組和燙傷組，燙傷組采用93±2℃蒸汽燙傷5s，假燙組采用37℃水浴處理5s；于處理后0h、3h、6h、12h、24h及48h切取背部皮膚組織，病理切片后，鏡下觀察組織病理變化；于傷后0h、3h、6h、12h、24h切取背部皮膚組織，病理切片后TUNEL染色法檢測創(chuàng)面內(nèi)KCs凋亡情況。 5.健康雌性BALB/c小鼠18只，背部脫毛后隨機分為對照組、DMEM組和ADSCs-CM組，采用93±2℃蒸汽燙傷5s，于傷后0h、2h、4h、分別以等量的無菌PBS、無血清DMEM培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)100%ADSCs-CM進(jìn)行表面濕敷和創(chuàng)面周圍相同部位進(jìn)行局部注射；于傷后6h切取背部皮膚，病理切片后TUNEL染色法檢測創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞凋亡情況；免疫組織化學(xué)法檢測組織內(nèi)Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平；Real-time PCR和Western-blot檢測Bcl-2、Caspase-3的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 研究結(jié)果 1.采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，與成纖維細(xì)胞類似，所培養(yǎng)的細(xì)胞在第3代時CD3l-、CD34-、CD45-、CD90+、CDl05+表達(dá)率均大于90%，符合ADSCs的免疫學(xué)表型；經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，其可向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞分化，證實培養(yǎng)的細(xì)胞為ADSCs。 2.原代培養(yǎng)的小鼠KCs形態(tài)較好，呈鋪路石狀樣，與典型的角質(zhì)形成細(xì)胞一致，傳至第3~5代后細(xì)胞易老化；HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)良好，細(xì)胞輪廓清晰呈典型的鋪路石狀，細(xì)胞狀態(tài)佳且穩(wěn)定，形態(tài)典型。利用51.5℃水浴孵育小鼠KCs和HaCaT細(xì)胞35s后，第3代小鼠KCs熱損傷后死亡較多，其即刻凋亡率波動較大，不具有穩(wěn)定性，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。熱損傷后HaCaT細(xì)胞部分死亡脫落，殘存的細(xì)胞胞體皺縮，細(xì)胞周圍出現(xiàn)高透亮光圈，即刻凋亡率為（9.8±0.45）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 3. ADSCs-CM可明顯的抑制饑餓引起的HaCaT細(xì)胞凋亡。HaCaT細(xì)胞于熱損傷后12h達(dá)到凋亡的峰值。利用體積分?jǐn)?shù)100%ADSCs-CM處理熱損傷后HaCaT細(xì)胞，其可在mRNA和蛋白水平明顯的上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而降低HaCaT細(xì)胞的凋亡率。處理12h后，體積分?jǐn)?shù)100%ADSCs-CM可明顯的緩解熱損傷引起的HaCaT細(xì)胞G2/M期阻滯。 4.利用93±2℃蒸汽作用于小鼠背部皮膚5s，可建立穩(wěn)定的深Ⅱ°燙傷模型。創(chuàng)面局部及殘存毛囊內(nèi)KCs于傷后6h達(dá)到凋亡的高峰。 5.在燙傷早期利用體積分?jǐn)?shù)100%ADSCs-CM處理燙傷創(chuàng)面，其可在mRNA和蛋白水平明顯的上調(diào)組織內(nèi)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)組織內(nèi)Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而減少KCs的凋亡數(shù)量。 研究結(jié)論 體外細(xì)胞實驗和小鼠在體實驗證明ADSCs可以在一定程度上抑制熱損傷引起的KCs的凋亡，而這種生物學(xué)效應(yīng)是ADSCs通過其旁分泌功能來上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Caspase-3的表達(dá)來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果提示在熱損傷引起的KCs凋亡中，ADSCs是通過旁分泌和調(diào)節(jié)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)的雙重機制來抑制細(xì)胞凋亡的，在燒傷創(chuàng)面治療早期具有一定的應(yīng)用潛力。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 燒傷 角質(zhì)形成細(xì)胞 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R644
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-28
• 實驗一 小鼠 ADSCS的分離培養(yǎng)與鑒定28-37
• 1 材料28-30
• 2 方法30-33
• 3 結(jié)果33-35
• 4 討論35-37
• 實驗二 小鼠 KCS的分離培養(yǎng)及熱損傷模型的建立37-47
• 1 材料37-38
• 2 方法38-42
• 3 結(jié)果42-45
• 4 討論45-47
• 實驗三 小鼠 ADSCS對熱損傷引起的 KCS凋亡的影響47-63
• 1 材料47-49
• 2 方法49-54
• 3 結(jié)果54-61
• 4 討論61-63
• 實驗四 小鼠深Ⅱ°燙傷模型的建立及創(chuàng)面內(nèi) KCS凋亡情況的檢測63-72
• 1 材料63-64
• 2 方法64-67
• 3 結(jié)果67-71
• 4 討論71-72
• 實驗五 ADSCS對燒傷創(chuàng)面內(nèi)殘存 KCS凋亡的影響72-86
• 1 材料72-75
• 2 方法75-79
• 3 結(jié)果79-84
• 4 討論84-86
• 小結(jié)86-88
• 參考文獻(xiàn)88-97
• 個人簡歷和研究成果97-99
• 致謝99-100

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Raquel Taléns-Visconti;Ana Bonora;Ramiro Jover;Vicente Mirabet;Francisco Carbonell;José Vicente Castell;María José Gómez-Lechón;;Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年36期

本文編號：737675