發(fā)布時(shí)間：2017-08-16 14:30

  本文關(guān)鍵詞：S1PR3特異性激動(dòng)劑上調(diào)巨噬細(xì)胞ROS水平促進(jìn)細(xì)菌清除改善膿毒癥小鼠預(yù)后

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【摘要】：研究背景膿毒癥(Sepsis)是指感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥,是臨床上一種常見(jiàn)且較難治療的綜合征。膿毒癥具有發(fā)病率高、死亡率高及醫(yī)療負(fù)擔(dān)重等特點(diǎn),全球每年有超過(guò)1800萬(wàn)嚴(yán)重膿毒癥病例,死亡率高達(dá)30-50%,是重癥監(jiān)護(hù)室(Intensive Care Unit,及ICU)患者的主要死因之一。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,其中感染和炎癥反應(yīng)在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在膿毒癥早期階段,感染引起促炎癥介質(zhì)的大量釋放,并由此導(dǎo)致嚴(yán)重的組織器官損傷,其中肺臟是膿毒癥的首位受累靶器官。若病情得不到及時(shí)控制,機(jī)體由免疫功能亢進(jìn)轉(zhuǎn)為免疫功能抑制,使得原發(fā)病原微生物和機(jī)會(huì)感染菌大量繁殖,最終導(dǎo)致患者死亡。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)細(xì)胞在免疫監(jiān)視及防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病原體可誘發(fā)巨噬細(xì)胞分泌多種生物活性物質(zhì),如NO、TNF-α、ROS等,其中ROS作為第二信使參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞內(nèi)適宜濃度的ROS可干擾細(xì)菌的DNA轉(zhuǎn)錄和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成,殺滅病菌或破壞細(xì)胞膜、干擾酶的功能,從而清除微生物。盡管以TLRs為首的模式識(shí)別受體及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)十分重要的地位,但近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)TLRs為靶向的膿毒癥治療并未取得理想效果。S1P受體(Sphingosine 1-phosphate receptor, S1PRs)是一類G蛋白偶聯(lián)受體,與磷酸分子1-磷酸硝胺醇(Sphingosine 1-phosphate, SIP)結(jié)合,啟動(dòng)細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng),介導(dǎo)S1P發(fā)揮其第一信使作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,血管生成和炎癥反應(yīng)。S1PR3作為S1PRs家族中一個(gè)主要成員,它與三種G蛋白發(fā)生偶聯(lián)(Gi、Gq、G12/G13),介導(dǎo)了廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)前,對(duì)S1PR3調(diào)控中樞及外周固有免疫細(xì)胞促炎作用的研究較為廣泛,而其在病原微生物清除中的作用并不明確。研究目的本研究旨在通過(guò)第一部分：設(shè)計(jì)合成S1PR3特異性激動(dòng)劑KRX-725,建立腹腔細(xì)菌感染膿毒癥模型,并特異性干預(yù)S1PR3功能,分析STPE3對(duì)膿毒癥小鼠生存率,細(xì)菌復(fù)合及肺臟損傷的影響。第二部分：體外觀察KRX-725對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)的調(diào)節(jié)作用,對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)菌清除功能的影響。探討S1PR3參與細(xì)菌清除的功能及其分子機(jī)制。研究方法采用大腸桿菌(E.coli)腹腔注射小鼠誘導(dǎo)膿毒癥模型。并采用S1PR3特異性激動(dòng)劑KRX-725于建模后進(jìn)行腹腔注射治療,對(duì)照組給予等體積的溶劑。兩組分別于治療后第8、16、24、32、40、48小時(shí),觀察膿毒癥小鼠生存率情況。KRX-725治療組及對(duì)照組分別于膿毒癥模型后24h,取外周血及腹腔灌洗液,按比例進(jìn)行梯度稀釋,LB平板培養(yǎng)過(guò)夜,計(jì)算出每毫升血液或腹腔灌洗液細(xì)菌集落數(shù)(colony forming units, CFU).并于建模后24小時(shí)取肺臟組織,固定、制作石蠟切片及HE染色,進(jìn)行肺損傷評(píng)分。體外Fluid Thioglycollate Medium誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,按比例應(yīng)用E.coli刺激小鼠巨噬細(xì)胞,時(shí)間分別為0 min,10min,20min,30min,40min,50min和60min,刺激結(jié)束后,檢測(cè)ROS水平。用同樣方法所得的腹腔巨噬細(xì)胞,進(jìn)行慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,生存率分析采用Log-rank Test,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1. 小鼠腹腔注射大腸桿菌,成功誘導(dǎo)膿毒癥模型,KRX-725治療組膿毒癥小鼠(n=12)生存率顯著高于對(duì)照組(n=12),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. 在KRX-725干預(yù)后24小時(shí),KRX-725治療組(n=5)每毫升血液中的CFU值顯著低于對(duì)照組(P0.05),兩組的腹腔灌洗液CFU值差異更為顯著(P0.01)。3. 在KRX-725治療后24h進(jìn)行觀察(n=3),對(duì)照組有典型的急性肺損傷的組織學(xué)改變,包括肺泡充血、大量炎性細(xì)胞滲出浸潤(rùn)、彌漫性肺泡損傷等,而KRX-725治療組肺損傷的組織學(xué)變化明顯減輕,其急性肺損傷評(píng)分也顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4. E.coli體外刺激巨噬細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,KRX-725治療組活性氧(ROS)的水平在第20min時(shí)明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),在第30min時(shí)差異最為顯著(P0.01)。5. 慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,KRX-725治療組細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌存活數(shù)明顯低于對(duì)照組(p0.05),6小時(shí)兩組之間的差異更為顯著(p0.01)。研究結(jié)論體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),S1PR3特異性激動(dòng)劑KRX-725可顯著改善膿毒癥小鼠生存率,并降低膿毒癥小鼠24小時(shí)腹腔及血液細(xì)菌負(fù)荷,減輕肺臟損傷。體外研究發(fā)現(xiàn),S1PR3特異性激動(dòng)劑通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞中活性氧(ROS)的水平,增強(qiáng)細(xì)胞清除細(xì)菌的能力,改善膿毒癥預(yù)后。該研究結(jié)果不僅為S1PR3在膿毒癥的早期防治機(jī)制的作用提供新的見(jiàn)解,也為膿毒癥和其他感染性疾病提供新的潛在的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：膿度癥 細(xì)菌清除 KRX-725 ROS 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-16
• 參考文獻(xiàn)14-16
• 第一部分 S1PR3特異性激動(dòng)劑對(duì)膿毒癥小鼠預(yù)后的影響16-29
• 1 材料與方法16-22
• 2 結(jié)果22-25
• 3 討論25-26
• 4 結(jié)論26-27
• 參考文獻(xiàn)27-29
• 第二部分 S1PR3特異性激動(dòng)劑對(duì)巨噬細(xì)胞殺菌功能的影響及機(jī)制29-38
• 1 材料與方法29-33
• 2 結(jié)果33-35
• 3 討論35-36
• 4 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-38
• 全文結(jié)論38-39
• 綜述39-61
• 參考文獻(xiàn)51-61
• 作者簡(jiǎn)歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文61

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本文編號(hào)：683808