本文關(guān)鍵詞：抗菌型間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建與功能鑒定

  更多相關(guān)文章： 膿毒癥 間充質(zhì)干細(xì)胞 基因修飾 抗菌蛋白 融合蛋白 殺菌/通透性增加蛋白 LL37

【摘要】：膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,病情惡化快,死亡率高,是嚴(yán)重?zé)�、�?chuàng)傷患者、腫瘤等危重病患者晚期死亡的主要原因。目前尚無針對膿毒癥的特效治療方法,當(dāng)前的治療方案仍是抗感染和涉及幾乎所有系統(tǒng)的全身支持治療,研究進(jìn)展也遲遲沒有突破。值得欣慰的是,近年來研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞不僅具有再生修復(fù)功能,還具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的特性。干細(xì)胞移植對于脊髓損傷、心肌缺血性損傷、急性肺損傷、急性腦損傷和骨股頭壞死等組織損傷性疾病的治療顯示了出好的療效。此外,干細(xì)胞移植治療膿毒癥方面也顯示出驚人在療效。干細(xì)胞一方面可通過旁分泌作用,分泌一些如TGF-β、IL-10、IL-13和TSG-6等抗炎細(xì)胞因子,進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng);另一方面,干細(xì)胞還可直接與樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞相互作用,直接調(diào)控這些免疫細(xì)胞的功能,在抗炎和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。動物實驗顯示干細(xì)胞移植治療膿毒癥有明顯的療效,大大降低的死亡率,并有效控制機(jī)體的過度炎癥反應(yīng)。殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)是一種從中性粒細(xì)胞初級顆粒中釋放的55kDa大小的抗菌肽,具有革蘭陰性細(xì)胞毒作用和LPS中和能力,是先天免疫系統(tǒng)的組成部分。r BPI21是由野生型BPI蛋白N?端的21 k Da的片段組成的重組蛋白,其較野生型蛋白具有更強(qiáng)、更穩(wěn)定的生物學(xué)功能。在基于動物實驗的研究中rBPI21被證實對肺炎、膿毒癥等感染性疾病都有保護(hù)效應(yīng),更重要的是其在臨床試驗中也顯示了治療效果。LL-37是Cathelicidin抗菌蛋白家族在人類身上的唯一成員,它可以被多種組織和細(xì)胞分泌,具有殺滅和抑制多種病原微生物生長的活性,不易耐藥,對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用,對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)了LL-37具有免疫調(diào)節(jié)和促愈的作用。本研究著眼于膿毒癥的疾病特點和研究現(xiàn)狀,提出“抗菌、抗內(nèi)毒素、抗炎和組織器官保護(hù)綜合治療”的治療策略,并尋求和驗證可應(yīng)用于該策略的治療藥物。目的:1.將rbpi21和與之類似的陽離子抗菌肽ll-37融合,以期獲得抗菌能力增強(qiáng)且具備免疫調(diào)節(jié)能力的抗菌融合蛋白。2.應(yīng)用構(gòu)建完成的bpi-ll37抗菌融合蛋白對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾,提高間充質(zhì)干細(xì)胞的抗菌和毒素中和能力,以期獲得具有殺菌、中和內(nèi)毒素的抗菌型間充質(zhì)干細(xì)胞。方法:通過pcr方法從bpi和ll-37基因的cdna中擴(kuò)增并突變獲得需要的rbpi21和ll37活性片斷,構(gòu)建rbpi21-ll37/ll37-rbpi21融合蛋白的表達(dá)載體,bpi蛋白質(zhì)和ll-37蛋白質(zhì)之間通過柔性片段(ggsgg)連接。之后將表達(dá)載體用瞬時轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入模式細(xì)胞a549中。后通過westernblot檢測a549細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的情況,通過抑菌試驗驗證此融合蛋白的分泌與抗菌能力。融合蛋白構(gòu)建成功后,將表達(dá)載體上的融合蛋白基因克隆至慢病毒載體中,并將其包裝成為具有生物活性的慢病毒顆粒。再用慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,以完成對其的基因修飾。之后通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志,通過westernblot鑒定感染后的mscs中融合蛋白的表達(dá)情況,通過抑菌試驗鑒定含有感染后的mscs外分泌物質(zhì)的培養(yǎng)上清是否具有抗菌能力。結(jié)果:1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、dna電泳和dna測序證實融合蛋白表達(dá)載體(plvx-bpi-ll-37)構(gòu)建成功;westernblot檢測結(jié)果表明融合蛋白rbpi21-ll37/ll37-rbpi21能被真核細(xì)胞a549細(xì)胞表達(dá),融合蛋白大小介于25~30kda;抑菌試驗進(jìn)一步驗證此融合蛋白具有抑制細(xì)菌生長的生物學(xué)效應(yīng)。2.成功的分離并培養(yǎng)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,對其的表面標(biāo)志鑒定和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)都符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。3.成功的包裝了融合蛋白慢病毒顆粒,應(yīng)用慢病毒感染完成了對間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾。流式細(xì)胞術(shù)顯示被修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞具有正常的細(xì)胞表型,westernblot檢測表明被修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)融合蛋白,且其培養(yǎng)上清具有抑菌能力。結(jié)論:1.構(gòu)建的兩種rbpi21-ll37/ll37-rbpi21表達(dá)載體能夠成功轉(zhuǎn)染入人的體細(xì)胞,并表達(dá)和分泌具有抗菌活性的融合蛋白。2.基因修飾后的間充質(zhì)干細(xì)胞具有正常的干細(xì)胞表型,可以表達(dá)和分泌抗菌融合蛋白,含有其外分泌物質(zhì)的培養(yǎng)上清具有抑菌能力。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 間充質(zhì)干細(xì)胞 基因修飾 抗菌蛋白 融合蛋白 殺菌/通透性增加蛋白 LL37
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 英文縮寫對照表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 BPI-LL37/LL37-BPI融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與功能鑒定13-37
• 2.1 材料與方法13-28
• 2.2 結(jié)果28-31
• 2.3 討論31-37
• 第三章 抗菌型間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建及功能鑒定37-52
• 3.1 材料與方法37-43
• 3.2 結(jié)果43-49
• 3.3 討論49-52
• 全文總結(jié)52-53
• 問題與展望53-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 文獻(xiàn)綜述 干細(xì)胞移植治療膿毒癥研究進(jìn)展61-70
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 攻讀碩士研究生期間撰寫及發(fā)表的論文70-71
• 致謝71

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本文編號：630912