發(fā)布時間：2017-08-06 18:15

  本文關鍵詞：抗菌型間充質干細胞的構建與功能鑒定

  更多相關文章： 膿毒癥 間充質干細胞 基因修飾 抗菌蛋白 融合蛋白 殺菌/通透性增加蛋白 LL37

【摘要】：膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征,病情惡化快,死亡率高,是嚴重燒、創(chuàng)傷患者、腫瘤等危重病患者晚期死亡的主要原因。目前尚無針對膿毒癥的特效治療方法,當前的治療方案仍是抗感染和涉及幾乎所有系統(tǒng)的全身支持治療,研究進展也遲遲沒有突破。值得欣慰的是,近年來研究發(fā)現(xiàn)干細胞不僅具有再生修復功能,還具有免疫調節(jié)和抗炎的特性。干細胞移植對于脊髓損傷、心肌缺血性損傷、急性肺損傷、急性腦損傷和骨股頭壞死等組織損傷性疾病的治療顯示了出好的療效。此外,干細胞移植治療膿毒癥方面也顯示出驚人在療效。干細胞一方面可通過旁分泌作用,分泌一些如TGF-β、IL-10、IL-13和TSG-6等抗炎細胞因子,進而調節(jié)機體的炎癥反應;另一方面,干細胞還可直接與樹突狀細胞、NK細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等免疫細胞相互作用,直接調控這些免疫細胞的功能,在抗炎和免疫調控中發(fā)揮重要作用。動物實驗顯示干細胞移植治療膿毒癥有明顯的療效,大大降低的死亡率,并有效控制機體的過度炎癥反應。殺菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)是一種從中性粒細胞初級顆粒中釋放的55kDa大小的抗菌肽,具有革蘭陰性細胞毒作用和LPS中和能力,是先天免疫系統(tǒng)的組成部分。r BPI21是由野生型BPI蛋白N?端的21 k Da的片段組成的重組蛋白,其較野生型蛋白具有更強、更穩(wěn)定的生物學功能。在基于動物實驗的研究中rBPI21被證實對肺炎、膿毒癥等感染性疾病都有保護效應,更重要的是其在臨床試驗中也顯示了治療效果。LL-37是Cathelicidin抗菌蛋白家族在人類身上的唯一成員,它可以被多種組織和細胞分泌,具有殺滅和抑制多種病原微生物生長的活性,不易耐藥,對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用,對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)了LL-37具有免疫調節(jié)和促愈的作用。本研究著眼于膿毒癥的疾病特點和研究現(xiàn)狀,提出“抗菌、抗內(nèi)毒素、抗炎和組織器官保護綜合治療”的治療策略,并尋求和驗證可應用于該策略的治療藥物。目的:1.將rbpi21和與之類似的陽離子抗菌肽ll-37融合,以期獲得抗菌能力增強且具備免疫調節(jié)能力的抗菌融合蛋白。2.應用構建完成的bpi-ll37抗菌融合蛋白對間充質干細胞進行基因修飾,提高間充質干細胞的抗菌和毒素中和能力,以期獲得具有殺菌、中和內(nèi)毒素的抗菌型間充質干細胞。方法:通過pcr方法從bpi和ll-37基因的cdna中擴增并突變獲得需要的rbpi21和ll37活性片斷,構建rbpi21-ll37/ll37-rbpi21融合蛋白的表達載體,bpi蛋白質和ll-37蛋白質之間通過柔性片段(ggsgg)連接。之后將表達載體用瞬時轉染方法導入模式細胞a549中。后通過westernblot檢測a549細胞表達融合蛋白的情況,通過抑菌試驗驗證此融合蛋白的分泌與抗菌能力。融合蛋白構建成功后,將表達載體上的融合蛋白基因克隆至慢病毒載體中,并將其包裝成為具有生物活性的慢病毒顆粒。再用慢病毒感染人臍帶間充質干細胞,以完成對其的基因修飾。之后通過流式細胞術鑒定感染后的間充質干細胞的細胞表面標志,通過westernblot鑒定感染后的mscs中融合蛋白的表達情況,通過抑菌試驗鑒定含有感染后的mscs外分泌物質的培養(yǎng)上清是否具有抗菌能力。結果:1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、dna電泳和dna測序證實融合蛋白表達載體(plvx-bpi-ll-37)構建成功;westernblot檢測結果表明融合蛋白rbpi21-ll37/ll37-rbpi21能被真核細胞a549細胞表達,融合蛋白大小介于25~30kda;抑菌試驗進一步驗證此融合蛋白具有抑制細菌生長的生物學效應。2.成功的分離并培養(yǎng)了人臍帶間充質干細胞,對其的表面標志鑒定和誘導分化培養(yǎng)都符合相應標準。3.成功的包裝了融合蛋白慢病毒顆粒,應用慢病毒感染完成了對間充質干細胞的基因修飾。流式細胞術顯示被修飾的間充質干細胞具有正常的細胞表型,westernblot檢測表明被修飾的間充質干細胞表達融合蛋白,且其培養(yǎng)上清具有抑菌能力。結論:1.構建的兩種rbpi21-ll37/ll37-rbpi21表達載體能夠成功轉染入人的體細胞,并表達和分泌具有抗菌活性的融合蛋白。2.基因修飾后的間充質干細胞具有正常的干細胞表型,可以表達和分泌抗菌融合蛋白,含有其外分泌物質的培養(yǎng)上清具有抑菌能力。
【關鍵詞】：膿毒癥 間充質干細胞 基因修飾 抗菌蛋白 融合蛋白 殺菌/通透性增加蛋白 LL37
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 英文縮寫對照表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 BPI-LL37/LL37-BPI融合蛋白表達載體的構建與功能鑒定13-37
• 2.1 材料與方法13-28
• 2.2 結果28-31
• 2.3 討論31-37
• 第三章 抗菌型間充質干細胞的構建及功能鑒定37-52
• 3.1 材料與方法37-43
• 3.2 結果43-49
• 3.3 討論49-52
• 全文總結52-53
• 問題與展望53-54
• 參考文獻54-61
• 文獻綜述 干細胞移植治療膿毒癥研究進展61-70
• 參考文獻67-70
• 攻讀碩士研究生期間撰寫及發(fā)表的論文70-71
• 致謝71

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本文編號：630912