本文關鍵詞：磷酸化HSP27保護燒傷血清刺激條件下血管內皮屏障的作用與機制研究

  更多相關文章： 燒傷 F-actin HSP27 SUMO化修飾 磷酸酶2A 內皮通透性

【摘要】：血管通透性增高是燒傷早期休克和臟器水腫的根本原因,其本質是血管內皮屏障通透性的增高,從而導致早期血管內液大量外滲,引發(fā)全身組織灌注減少和組織器官水腫。由于燒傷早期血管通透性增高機制尚未得到充分證實,目前臨床上缺少有效的防治措施。因此,深入揭示燒傷后微血管通透性變化的分子調節(jié)機制,研究防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略,具有重要的理論價值和臨床意義。內皮細胞回縮是多種病理生理(包括燒傷)條件下內皮細胞間裂隙形成、微血管通透性增高的重要基礎。以往認為,應力纖維中F-actin與肌球蛋白相互作用,產生向心收縮力,是內皮細胞回縮的骨架基礎,而HSP27磷酸化則是應力纖維形成的重要分子機制。然而,最近有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化HSP27通過促進應力纖維形成或保護F-actin骨架,顯著降低了缺氧或急性炎癥等條件下血管內皮通透性。p38激酶/MK2是HSP27磷酸化的關鍵信號途徑。我們以往發(fā)現(xiàn),燒傷后血管內皮通透性增高并不與應力纖維形成相平行。燒傷后內皮細胞F-actin骨架發(fā)生了復雜變化,即:早期形成應力纖維,后期F-actin破壞、解聚或排列紊亂。我們前期預實驗結果顯示,燒傷血清刺激條件下內皮細胞HSP27磷酸化水平僅短暫升高。鑒于磷酸化HSP27降低血管通透性作用的相關認識,我們推測,p38激酶-HSP27磷酸化很可能是燒傷后血管內皮屏障的重要保護性適應機制,只是隨著時間延長,促通透性因素的級聯(lián)放大,p38激酶-HSP27磷酸化這一保護性適應機制不斷削弱,使得血管通透性增高。本項目提出HSP27磷酸化是燒傷后血管內皮屏障的重要保護性適應機制的假設。擬以燒傷患者血清為刺激因素,以大鼠微血管內皮細胞為對象,采用基因突變技術構建磷酸化和非磷酸化HSP27表達突變體,探討HSP27的磷酸化狀態(tài)與燒傷血清刺激條件下肺血管內皮細胞應力纖維形成和通透性變化的關系;從蛋白磷酸酶PP2A調節(jié)HSP27去磷酸化和SUMO化修飾對MK2活性的抑制作用兩方面,初步明確HSP27磷酸化隨時間削弱的分子機制。研究對深入揭示燒傷后微血管通透性變化的分子調節(jié)機制,從細胞內源性保護角度促成防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略,具有重要意義。一、研究目的探討磷酸化hsp27在燒傷血清刺激誘導血管內皮通透性變化中的作用及其調節(jié)機制。二、研究內容1.hsp27磷酸化、蛋白表達和分布與內皮細胞應力纖維形成、通透性變化關系的研究2.hsp27磷酸化在燒傷血清刺激誘導血管內皮通透性變化中的作用3.pp2a與mk2的sumo化修飾對hsp27磷酸化的調節(jié)作用研究三、研究方法1.按常規(guī)方法收集嚴重燒傷患者血清(淺二度、深二度和三度燒傷面積50%的患者)2.培養(yǎng)大鼠肺微血管內皮細胞,利用transwell小室建立單層內皮細胞通透性實驗模型,采用跨單層內皮細胞電阻法(teer)評估內皮單層通透性變化。3.采用細胞免疫熒光化學染色技術觀察內皮細胞zo-1、f-actin形態(tài)分布變化;采用imagej軟件計算內皮細胞間隙和細胞表面積變化。4.采用westernblot技術檢測燒傷血清刺激條件下內皮細胞p38激酶、mk2和hsp27磷酸化水平以及mk2的sumo化修飾。5.構建磷酸化、非磷酸化和野生型hsp27腺病毒高表達載體,并成功轉染內皮細胞。6.采用oa抑制pp2a和轉染senp1腺病毒抑制mk2的sumo化修飾,探討pp2a去磷酸化作用和sumo化修飾抑制mk2活性對hsp27磷酸化的調節(jié)作用。四、主要結果1.燒傷血清刺激1h,肺微血管內皮細胞通透性顯著增強,隨著刺激時間延長,通透性進一步增強;同時,細胞間緊密連接完整性破壞,伴細胞間裂隙增加和細胞表面積縮小。2.燒傷血清刺激0.5h,內皮細胞中央型f-actin應力纖維形成增多;隨著刺激時間延長,中央型f-actin應力纖維消失,代之以不規(guī)則的細胞周邊型f-actin形成增多。3.燒傷血清使p38mapk-mk2-hsp27信號通路激活;其中,p38mapk/mk2呈持續(xù)活化,而hsp27磷酸化僅在燒傷血清刺激0.5h時大幅增強,隨后迅速回落。hsp27磷酸化瞬時增強與內皮細胞應力纖維形成時間相吻合,二者高峰均出現(xiàn)于內皮細胞通透性增高之前。4.構建的磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表達載體能有效轉染內皮細胞并高表達目的蛋白。較之非磷酸化HSP27和空載體轉染對照組,磷酸化HSP27轉染能顯著抑制燒傷血清導致的內皮細胞高通透性,使細胞中央型F-actin應力纖維形成增多。此外,磷酸化HSP27可以部分對抗細胞松弛素D導致的內皮通透性增高。5.內皮細胞PP2A可與HSP27發(fā)生相互作用,且這一作用在燒傷血清刺激條件下進一步增強,抑制PP2A可使燒傷血清刺激條件下內皮細胞HSP27磷酸化部分增強。內皮細胞中MK2存在SUMO化修飾,且該修飾作用在燒傷血清刺激條件下進一步增強。高表達SENP1可顯著解除SUMO蛋白對MK2活性的抑制作用,使HSP27的磷酸化水平升高。6.HSP27磷酸化是維護燒傷血清刺激條件下內皮細胞屏障功能的適應性保護反應,其通過促進中央型F-actin應力纖維形成對抗血管內皮高通透性。PP2A對HSP27的去磷酸化作用和SUMO化修飾對MK2活性的抑制作用是燒傷血清刺激條件下HSP27磷酸化迅速削弱的重要分子機制。
【關鍵詞】：燒傷 F-actin HSP27 SUMO化修飾 磷酸酶2A 內皮通透性
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R644
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 HSP27 磷酸化、蛋白表達和分布與內皮細胞應力纖維形成、通透性變化關系的研究15-29
• 2.1 材料與方法15-23
• 2.2 結果23-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結27-29
• 第三章 磷酸化HSP27在燒傷血清誘導血管內皮高通透性中的作用與機制29-39
• 3.1 材料與方法29-32
• 3.2 結果32-37
• 3.3 討論37-38
• 3.4 小結38-39
• 第四章 燒傷后內皮細胞HSP27磷酸化隨時間削弱的分子調節(jié)機制39-48
• 4.1 材料與方法39-42
• 4.2 結果42-46
• 4.3 討論46-47
• 4.4 小結47-48
• 全文結論48-49
• 參考文獻49-52
• 文獻綜述 血管內皮通透性的體外檢測方法52-58
• 參考文獻56-58
• 攻讀學位期間的研究成果58-59
• 致謝59

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本文編號：580751