本文關(guān)鍵詞：水母毒素致腎臟損傷的機(jī)制研究

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【摘要】：近年來(lái)，包括中國(guó)近海水域在內(nèi)的全球許多海域都出現(xiàn)了水母暴發(fā)現(xiàn)象。同時(shí)，人類涉海活動(dòng)逐漸增多，水母蜇傷成為最常見(jiàn)的海洋生物傷。水母通過(guò)發(fā)射刺絲注入毒液來(lái)捕食和進(jìn)行防御，蜇傷人或動(dòng)物。文獻(xiàn)報(bào)道，人類被水母蜇傷后，會(huì)出現(xiàn)皮膚過(guò)敏、疼痛甚至心肺衰竭。研究表明水母毒素能夠?qū)е聡?yán)重的局部和全身性疾病，嚴(yán)重時(shí)還可致人死亡。日益多發(fā)的水母蜇傷事件引起沿海漁民和游客的恐慌。 發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）毒性相對(duì)比較溫和，未見(jiàn)致死病例報(bào)道，但其在我國(guó)近海廣泛分布，是我國(guó)東南海域主要的致傷水母之一。水母蜇傷后，有一部分患者出現(xiàn)遲發(fā)的多器官功能損傷，本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)發(fā)形霞水母觸手提取物（tentacle extract, TE）能夠誘導(dǎo)模型動(dòng)物的腎臟損傷。我們發(fā)現(xiàn)TE作用后，大鼠腎臟皮質(zhì)部分腎小球囊腔以及腎小管腔內(nèi)出現(xiàn)大量空泡及透明質(zhì)樣物質(zhì)，腎髓質(zhì)血管床大量開放，腎小管上皮細(xì)胞脫落壞死，進(jìn)一步電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，腎小球?yàn)V過(guò)膜無(wú)明顯變化，腎小管上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，但具體的損傷機(jī)制尚不明確。因此本課題以損傷最為嚴(yán)重的腎小管上皮細(xì)胞為主要研究對(duì)象，探索TE對(duì)腎臟特別是腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。本文第一部分重點(diǎn)研究TE對(duì)大鼠腎臟的損傷機(jī)制，第二部分重點(diǎn)研究膜保護(hù)劑聚乙二醇（PEG）對(duì)腎細(xì)胞損傷的干預(yù)效果。 方法 第一部分：發(fā)形霞水母觸手提取物致大鼠腎臟損傷的機(jī)制研究 制作水母毒素遲發(fā)性臟器損傷大鼠模型，取其腎臟標(biāo)本，用TUNEL法檢測(cè)大鼠腎臟組織細(xì)胞的凋亡，并用免疫組化方法檢測(cè)腎臟中Caspase-3表達(dá)。利用MTT法檢測(cè)不同濃度TE對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E存活率的影響，并用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。使用Annexin V-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。通過(guò)雙向電泳篩選膜上差異蛋白和激光共聚焦測(cè)定胞漿Ca2+濃度的變化來(lái)說(shuō)明細(xì)胞凋亡膜受體通路在腎細(xì)胞損傷中的作用。通過(guò)蛋白免疫印跡法測(cè)定凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，，并利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位和活性氧（ROS）的改變，結(jié)合TBA比色法檢測(cè)氧化指標(biāo)MDA來(lái)明確細(xì)胞凋亡線粒體通路在腎小管細(xì)胞損傷中的作用。 第二部分：聚乙二醇（PEG）對(duì)TE導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的干預(yù)效果 在PEG6000的干預(yù)下，用TE刺激細(xì)胞。MTT法檢測(cè)PEG6000對(duì)NRK-52E細(xì)胞生存率的干預(yù)效果，用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用Annexin V-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位和ROS水平，TBA比色法檢測(cè)MDA水平。 結(jié)果 第一部分：發(fā)形霞水母觸手提取物致大鼠腎臟損傷的機(jī)制研究 與正常大鼠腎臟對(duì)照，水母毒素延遲毒性綜合征模型大鼠的腎臟切片Tunel染色觀察到大量棕黃色凋亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片，且Caspase-3的表達(dá)升高。TE對(duì)NRK-52E細(xì)胞的毒性具有時(shí)間和劑量依賴性，細(xì)胞在TE作用下會(huì)出現(xiàn)皺縮等形態(tài)變化。TE濃度越大，凋亡與壞死的細(xì)胞越多。雙向電泳未篩選到TE作用前后細(xì)胞膜上的差異蛋白。TE能夠使胞漿內(nèi)鈣離子濃度升高，常用的鈣拮抗劑不能抑制這一現(xiàn)象。PEG6000對(duì)于TE引起的NRK-52E和HEK-293（人胚胎腎細(xì)胞）胞內(nèi)鈣升高都有顯著的抑制作用。TE作用后，NRK-52E細(xì)胞Caspase-8,-9,-3表達(dá)升高，ROS與MDA水平升高，線粒體膜電位降低。 第二部分：聚乙二醇（PEG）對(duì)TE導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的干預(yù)效果 在濃度為25mM的PEG6000干預(yù)下，TE不引起NRK-52E細(xì)胞形態(tài)明顯變化，且細(xì)胞存活率顯著提高。PEG6000能夠緩解細(xì)胞的凋亡與壞死，抑制TE引起的細(xì)胞ROS與MDA水平升高，維持線粒體膜電位。 結(jié)論 TE引起腎小管上皮細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+超載的來(lái)源是細(xì)胞外鈣內(nèi)流，且外鈣內(nèi)流的途徑并不是已知的膜上鈣通道，而是通過(guò)水母毒素在細(xì)胞膜上形成的孔道�？椎佬纬赡軌蛞鸫罅库c離子、鈣離子內(nèi)流，鉀離子從細(xì)胞內(nèi)流出，改變細(xì)胞滲透壓，引起線粒體膜電位降低，胞內(nèi)活性氧堆積，觸發(fā)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。 膜促融劑PEG6000能夠從上游干預(yù)孔道的形成，從而抑制鈣超載、活性氧簇堆積等下游反應(yīng)，對(duì)水母毒素的損傷效應(yīng)起到保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：水母 觸手提取物 孔道形成 凋亡 線粒體
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R646
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫詞10-11
• 前言11-13
• 第一部分 發(fā)形霞水母觸手提取物致大鼠腎臟損傷的機(jī)制研究13-48
• 一、前言13
• 二、材料和方法13-27
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-46
• 四、討論46-48
• 第二部分 聚乙二醇對(duì) TE 導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的干預(yù)效果48-58
• 一、前言48
• 二、材料和方法48-50
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-56
• 四、討論56-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 文獻(xiàn)綜述62-72
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 附錄72-74
• 致謝74-75

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 劉偉,王娟,姜孝玉,楊文利,徐安龍;�？芗�(xì)胞素的研究進(jìn)展[J];海洋科學(xué);2005年04期

2 孫曉霞;王世偉;孫松;;Introduction to the China Jellyfish Project——The Key Processes,Mechanism and Ecological Consequences of Jellyfish Bloom in China Coastal Waters[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2011年02期

本文編號(hào)：547142