本文關鍵詞：Tim-3在膿毒血癥中的免疫調節(jié)及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:T細胞免疫球蛋白粘附分子-3（T cell Ig and mucin domain protein3,Tim-3）最初被發(fā)現于活化的Th1、Th17、Tc1效應細胞上，與其天然配體半乳糖結合蛋白-9（Galectin-9，Gal-9）結合后可誘導T效應細胞的凋亡，下調免疫反應，誘導免疫耐受。然而隨著研究的深入，人們發(fā)現Tim-3也表達在DC、巨噬細胞等天然免疫細胞上，并參與天然免疫的調節(jié)。由于Tim-3在天然免疫和適應性免疫反應中均具有重要的作用，所以它的表達失調與很多臨床疾病相關。Tim-3的低表達與T細胞功能增強的自身免疫性疾病有關，如多發(fā)性硬化和自身免疫性肝炎；Tim-3的過表達與T細胞功能喪失相關的疾病有關，如腫瘤或慢性細菌性感染。膿毒血癥是由感染誘發(fā)的全身性過度炎癥反應。據統計全球每年有1800萬人發(fā)病，在非休克患者中，其死亡率為30％—40％，而在休克患者中其死亡率則高達70%—90%。即便在發(fā)達國家如美國，一年就有近25萬膿毒血癥死亡病例。膿毒血癥發(fā)病率仍存在上升的趨勢，，但目前尚缺乏有效的診治手段。另外有越來越多的數據顯示，參與天然免疫反應的Tim-3具有免疫自穩(wěn)調節(jié)的功能。Tim-3是否能夠促進膿毒血癥的免疫自穩(wěn)，成為治療膿毒血癥的新措施，目前還不清楚。 目的:Tim-3在天然免疫和適應性免疫應答中起非常重要的免疫調節(jié)作用，探究該分子在膿毒血癥中的可能免疫調節(jié)作用及其機制。 方法:1、收集膿毒血癥患者血標本，觀察不同病情患者Tim-3表達情況；構建經典膿毒血癥動物模型—盲腸結扎穿刺術，觀察模型發(fā)病過程中Tim-3的動態(tài)變化；給予Tim-3單抗或者Tim-3融合蛋白，觀察Tim-3通路阻斷后，CLP生存率和脾臟細胞因子變化情況。2、觀察Tim-3單抗對CLP腹腔巨噬表達細胞細胞因子的影響；觀察CLP不同嚴重程度時，腹腔巨噬細胞表達Tim-3情況；觀察穩(wěn)定低/高表達Tim-3RAW264.7細胞系的吞噬能力及其對TLRs激動劑的反應性。3、檢測RAW264.7細胞系/小鼠腹腔巨噬細胞受到不同濃度LPS或不同時間點LPS刺激后，Tim-3表達情況； Tim-3單抗對LPS模型脾臟細胞因子的影響；Tim-3單抗對TLR4-KO-CLP的生存率和脾臟細胞因子影響。 結果:1、與輕度膿毒血癥患者相比，重癥患者外周血中表達Tim-3下降；CLP模型隨著時間的延長，Tim-3表達呈先升高后下降的趨勢，并且與sham相比，CLP小鼠Tim-3表達下降；給予Tim-3單抗或者Tim-3融合蛋白，Tim-3通路阻斷，CLP生存率下降，脾臟細胞因子（IL-1β、IL-6、TLR4等）均呈現上升趨勢。2、Tim-3單抗阻斷CLP體內Tim-3通路后， CLP腹腔巨噬表達細胞細胞因子呈升高趨勢；與sham相比，CLP小鼠腹腔巨噬細胞表達Tim-3下降；觀察穩(wěn)定低/高表達Tim-3RAW264.7細胞系的吞噬能力及其對TLRs激動劑的反應性，發(fā)現Tim-3表達下降時細胞系的吞噬能力提高，對TLRs的反應性升高，Tim-3表達升高時變化相反。3、檢測RAW264.7細胞系受到不同濃度LPS或不同時間點LPS刺激后，Tim-3表達呈雙向趨勢，小鼠腹腔巨噬細胞受到不同LPS刺激后，隨著LPS濃度升高Tim-3表達下降；LPS模型時， Tim-3單抗阻斷Tim-3通路后，脾臟細胞因子呈升高趨勢； Tim-3單抗對TLR4-KO-CLP的生存率和脾臟細胞因子沒有明顯影響。 結論:Tim-3低表達或者Tim-3通路的阻斷后膿毒血癥病情加重。因此Tim-3可能在維持膿毒血癥的免疫自穩(wěn)機制中發(fā)揮了一定的作用。另外，巨噬細胞的過度活化能夠導致膿毒血癥的系統性炎癥反應。當阻斷Tim-3通路或者低表達Tim-3時，巨噬細胞的活化程度卻能夠明顯增強；當巨噬細胞高表達Tim-3時，該細胞上TLRs介導的促炎因子的合成明顯受到抑制，這表明Tim-3是TLRs介導的免疫反應的負調控因子。TLR4與Tim-3通路具有相互抑制的作用， TLR4是Tim-3負調控反應中重要的調節(jié)因子。因此，Tim-3通過抑制TLR4反應維持膿毒血癥的免疫自穩(wěn)。
【關鍵詞】：Tim-3 膿毒血癥 TLR4 巨噬細胞 負調控
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略詞表9-10
• 目錄10-13
• 引言13-17
• 第一部分 Tim-3 在膿毒血癥中的表達17-31
• 1.1 引言17
• 1.2 材料與設備17-18
• 1.2.1 實驗動物17
• 1.2.2 試劑17
• 1.2.3 設備17-18
• 1.3 方法18-23
• 1.3.1 麻醉藥的配置18
• 1.3.2 建立小鼠膿毒血癥模型18
• 1.3.3 取小鼠腹腔灌洗液18-19
• 1.3.4 取小鼠脾淋巴細胞19
• 1.3.5 除蛋白中的內毒素19
• 1.3.6 蛋白定量（按照 BCA 蛋白定量試劑盒操作）19-20
• 1.3.7 細胞總 RNA 提取步驟20
• 1.3.8 反轉錄步驟20-21
• 1.3.9 實時定量 PCR 步驟21
• 1.3.10 引物序列21-22
• 1.3.11 ELISA （檢測依據細胞因子檢測試劑盒說明書）22-23
• 1.3.12 統計學處理23
• 1.4 結果23-29
• 1.4.1 Tim-3 在膿毒血癥中的表達23-26
• 1.4.2 Tim-3 參與膿毒血癥的病理過程26-29
• 1.5 討論29-31
• 第二部分 Tim-3 在膿毒血癥中的作用機制研究（一）31-41
• 2.1 引言31
• 2.2 材料與設備31-32
• 2.2.1 細胞系31
• 2.2.2 試劑31
• 2.2.3 設備31-32
• 2.3 方法32-33
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)32
• 2.3.2 細胞的凍存32
• 2.3.3 巨噬細胞的分選32
• 2.3.4 Tim-3 通路阻斷對 CLP 脾臟巨噬細胞細胞因子影響實驗32-33
• 2.3.5 腹腔巨噬細胞吞噬能力檢測33
• 2.3.6 統計學處理33
• 2.4 結果33-37
• 2.4.1 阻斷 Tim-3 通路或者 Tim-3 的低表達能增強巨噬細胞反應33-36
• 2.4.2 過表達 Tim-3 的巨噬細胞能夠抑制 TLRs 誘導的促炎因子的產生36-37
• 2.5 討論37-41
• 第三部分 Tim-3 在膿毒血癥中的作用機制研究（二）41-51
• 3.1 引言41
• 3.2 材料41
• 3.2.1 實驗動物41
• 3.2.2 試劑41
• 3.2.3 設備41
• 3.3 方法41-43
• 3.3.1 內毒素血癥模型的構建41-42
• 3.3.2 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖42
• 3.3.3 小鼠尾部基因組 DNA 的提取42-43
• 3.3.4 PCR 反應43
• 3.3.5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定43
• 3.4 結果43-48
• 3.4.1 TLR4 參與了 Tim-3 介導的反應43-45
• 3.4.2 Tim-3 能夠通過抑制 TLR4 反應，維持機體的免疫自穩(wěn)45-46
• 3.4.3 小鼠的繁殖情況及其基因型鑒定結果46-47
• 3.4.4 阻斷 TLR4-KO 小鼠上 Tim-3 通路不能明顯影響膿毒血癥的病理過程47-48
• 3.5 討論48-51
• 參考文獻51-53
• 綜述53-60
• 參考文獻57-60
• 碩士期間獲得成果60-62
• 致謝62-65
• 發(fā)表文章65-80

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

1 李曼;陸林;沈衛(wèi)峰;;高遷移率族蛋白B1與心血管疾病關系的研究進展[J];國際心血管病雜志;2013年04期

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本文編號：498191