本文關(guān)鍵詞：Tim-3在膿毒血癥中的免疫調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:T細(xì)胞免疫球蛋白粘附分子-3（T cell Ig and mucin domain protein3,Tim-3）最初被發(fā)現(xiàn)于活化的Th1、Th17、Tc1效應(yīng)細(xì)胞上，與其天然配體半乳糖結(jié)合蛋白-9（Galectin-9，Gal-9）結(jié)合后可誘導(dǎo)T效應(yīng)細(xì)胞的凋亡，下調(diào)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。然而隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)在DC、巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞上，并參與天然免疫的調(diào)節(jié)。由于Tim-3在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均具有重要的作用，所以它的表達(dá)失調(diào)與很多臨床疾病相關(guān)。Tim-3的低表達(dá)與T細(xì)胞功能增強(qiáng)的自身免疫性疾病有關(guān)，如多發(fā)性硬化和自身免疫性肝炎；Tim-3的過表達(dá)與T細(xì)胞功能喪失相關(guān)的疾病有關(guān)，如腫瘤或慢性細(xì)菌性感染。膿毒血癥是由感染誘發(fā)的全身性過度炎癥反應(yīng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年有1800萬人發(fā)病，在非休克患者中，其死亡率為30％—40％，而在休克患者中其死亡率則高達(dá)70%—90%。即便在發(fā)達(dá)國家如美國，一年就有近25萬膿毒血癥死亡病例。膿毒血癥發(fā)病率仍存在上升的趨勢，，但目前尚缺乏有效的診治手段。另外有越來越多的數(shù)據(jù)顯示，參與天然免疫反應(yīng)的Tim-3具有免疫自穩(wěn)調(diào)節(jié)的功能。Tim-3是否能夠促進(jìn)膿毒血癥的免疫自穩(wěn)，成為治療膿毒血癥的新措施，目前還不清楚。 目的:Tim-3在天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起非常重要的免疫調(diào)節(jié)作用，探究該分子在膿毒血癥中的可能免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。 方法:1、收集膿毒血癥患者血標(biāo)本，觀察不同病情患者Tim-3表達(dá)情況；構(gòu)建經(jīng)典膿毒血癥動物模型—盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)，觀察模型發(fā)病過程中Tim-3的動態(tài)變化；給予Tim-3單抗或者Tim-3融合蛋白，觀察Tim-3通路阻斷后，CLP生存率和脾臟細(xì)胞因子變化情況。2、觀察Tim-3單抗對CLP腹腔巨噬表達(dá)細(xì)胞細(xì)胞因子的影響；觀察CLP不同嚴(yán)重程度時，腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)Tim-3情況；觀察穩(wěn)定低/高表達(dá)Tim-3RAW264.7細(xì)胞系的吞噬能力及其對TLRs激動劑的反應(yīng)性。3、檢測RAW264.7細(xì)胞系/小鼠腹腔巨噬細(xì)胞受到不同濃度LPS或不同時間點(diǎn)LPS刺激后，Tim-3表達(dá)情況； Tim-3單抗對LPS模型脾臟細(xì)胞因子的影響；Tim-3單抗對TLR4-KO-CLP的生存率和脾臟細(xì)胞因子影響。 結(jié)果:1、與輕度膿毒血癥患者相比，重癥患者外周血中表達(dá)Tim-3下降；CLP模型隨著時間的延長，Tim-3表達(dá)呈先升高后下降的趨勢，并且與sham相比，CLP小鼠Tim-3表達(dá)下降；給予Tim-3單抗或者Tim-3融合蛋白，Tim-3通路阻斷，CLP生存率下降，脾臟細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TLR4等）均呈現(xiàn)上升趨勢。2、Tim-3單抗阻斷CLP體內(nèi)Tim-3通路后， CLP腹腔巨噬表達(dá)細(xì)胞細(xì)胞因子呈升高趨勢；與sham相比，CLP小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)Tim-3下降；觀察穩(wěn)定低/高表達(dá)Tim-3RAW264.7細(xì)胞系的吞噬能力及其對TLRs激動劑的反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)Tim-3表達(dá)下降時細(xì)胞系的吞噬能力提高，對TLRs的反應(yīng)性升高，Tim-3表達(dá)升高時變化相反。3、檢測RAW264.7細(xì)胞系受到不同濃度LPS或不同時間點(diǎn)LPS刺激后，Tim-3表達(dá)呈雙向趨勢，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞受到不同LPS刺激后，隨著LPS濃度升高Tim-3表達(dá)下降；LPS模型時， Tim-3單抗阻斷Tim-3通路后，脾臟細(xì)胞因子呈升高趨勢； Tim-3單抗對TLR4-KO-CLP的生存率和脾臟細(xì)胞因子沒有明顯影響。 結(jié)論:Tim-3低表達(dá)或者Tim-3通路的阻斷后膿毒血癥病情加重。因此Tim-3可能在維持膿毒血癥的免疫自穩(wěn)機(jī)制中發(fā)揮了一定的作用。另外，巨噬細(xì)胞的過度活化能夠?qū)е履摱狙Y的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。當(dāng)阻斷Tim-3通路或者低表達(dá)Tim-3時，巨噬細(xì)胞的活化程度卻能夠明顯增強(qiáng)；當(dāng)巨噬細(xì)胞高表達(dá)Tim-3時，該細(xì)胞上TLRs介導(dǎo)的促炎因子的合成明顯受到抑制，這表明Tim-3是TLRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子。TLR4與Tim-3通路具有相互抑制的作用， TLR4是Tim-3負(fù)調(diào)控反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)因子。因此，Tim-3通過抑制TLR4反應(yīng)維持膿毒血癥的免疫自穩(wěn)。
【關(guān)鍵詞】：Tim-3 膿毒血癥 TLR4 巨噬細(xì)胞 負(fù)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略詞表9-10
• 目錄10-13
• 引言13-17
• 第一部分 Tim-3 在膿毒血癥中的表達(dá)17-31
• 1.1 引言17
• 1.2 材料與設(shè)備17-18
• 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物17
• 1.2.2 試劑17
• 1.2.3 設(shè)備17-18
• 1.3 方法18-23
• 1.3.1 麻醉藥的配置18
• 1.3.2 建立小鼠膿毒血癥模型18
• 1.3.3 取小鼠腹腔灌洗液18-19
• 1.3.4 取小鼠脾淋巴細(xì)胞19
• 1.3.5 除蛋白中的內(nèi)毒素19
• 1.3.6 蛋白定量（按照 BCA 蛋白定量試劑盒操作）19-20
• 1.3.7 細(xì)胞總 RNA 提取步驟20
• 1.3.8 反轉(zhuǎn)錄步驟20-21
• 1.3.9 實(shí)時定量 PCR 步驟21
• 1.3.10 引物序列21-22
• 1.3.11 ELISA （檢測依據(jù)細(xì)胞因子檢測試劑盒說明書）22-23
• 1.3.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理23
• 1.4 結(jié)果23-29
• 1.4.1 Tim-3 在膿毒血癥中的表達(dá)23-26
• 1.4.2 Tim-3 參與膿毒血癥的病理過程26-29
• 1.5 討論29-31
• 第二部分 Tim-3 在膿毒血癥中的作用機(jī)制研究（一）31-41
• 2.1 引言31
• 2.2 材料與設(shè)備31-32
• 2.2.1 細(xì)胞系31
• 2.2.2 試劑31
• 2.2.3 設(shè)備31-32
• 2.3 方法32-33
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)32
• 2.3.2 細(xì)胞的凍存32
• 2.3.3 巨噬細(xì)胞的分選32
• 2.3.4 Tim-3 通路阻斷對 CLP 脾臟巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子影響實(shí)驗(yàn)32-33
• 2.3.5 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力檢測33
• 2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理33
• 2.4 結(jié)果33-37
• 2.4.1 阻斷 Tim-3 通路或者 Tim-3 的低表達(dá)能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞反應(yīng)33-36
• 2.4.2 過表達(dá) Tim-3 的巨噬細(xì)胞能夠抑制 TLRs 誘導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生36-37
• 2.5 討論37-41
• 第三部分 Tim-3 在膿毒血癥中的作用機(jī)制研究（二）41-51
• 3.1 引言41
• 3.2 材料41
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)動物41
• 3.2.2 試劑41
• 3.2.3 設(shè)備41
• 3.3 方法41-43
• 3.3.1 內(nèi)毒素血癥模型的構(gòu)建41-42
• 3.3.2 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖42
• 3.3.3 小鼠尾部基因組 DNA 的提取42-43
• 3.3.4 PCR 反應(yīng)43
• 3.3.5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定43
• 3.4 結(jié)果43-48
• 3.4.1 TLR4 參與了 Tim-3 介導(dǎo)的反應(yīng)43-45
• 3.4.2 Tim-3 能夠通過抑制 TLR4 反應(yīng)，維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)45-46
• 3.4.3 小鼠的繁殖情況及其基因型鑒定結(jié)果46-47
• 3.4.4 阻斷 TLR4-KO 小鼠上 Tim-3 通路不能明顯影響膿毒血癥的病理過程47-48
• 3.5 討論48-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 綜述53-60
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 碩士期間獲得成果60-62
• 致謝62-65
• 發(fā)表文章65-80

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 李曼;陸林;沈衛(wèi)峰;;高遷移率族蛋白B1與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];國際心血管病雜志;2013年04期

2 翟振麗;馬維紅;李全忠;申煒;陽躍忠;;載脂蛋白A1誘導(dǎo)骨髓源性巨噬細(xì)胞向抗炎性M2型極化的作用[J];中國動脈硬化雜志;2013年10期

3 單小鷗;李昌崇;;105例社區(qū)獲得性兒童敗血癥病原學(xué)及體外耐藥分析[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2008年05期

4 宋振舉;酈珊珊;童朝陽;孫湛;姚晨玲;黃培志;;膿毒癥患者血清炎癥/抗炎癥細(xì)胞因子濃度與預(yù)后的相關(guān)性研究[J];中國急救醫(yī)學(xué);2008年09期

5 徐磊磊;周義軍;宋興華;丁俐文;陳江濤;王

本文編號：498191