本文關鍵詞：常氧和低氧條件下的骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液減輕機械通氣造成的大鼠急性肺損傷，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 急性肺損傷（acutelunginjury,ALI）是肺內(nèi)外多種致病因素導致的肺泡-毛細血管膜彌漫性損傷，肺組織充血、水腫的急性病理過程，發(fā)展至嚴重階段為急性呼吸窘迫綜合癥（acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS）。ARDS嚴重影響肺臟氣體交換功能，臨床表現(xiàn)為進行性呼吸困難和頑固低氧血癥，死亡率高達40%以上。其發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為，炎癥反應-抗炎反應失衡是ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展最重要的病理生理機制。近年來對ALI/ARDS的治療藥物和措施進行了大量研究，業(yè)已證實呼吸支持治療仍是當前的主要救治手段，治療藥物的研究尚未取得突破性進展。 骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow-derivedmesenchymalstemcells，MSCs）是一類具有不同的自我更新能力和多向分化潛能的未分化細胞，歸巢到肺臟損傷部位后可分化為肺內(nèi)多種細胞參與修復。無論是氣管內(nèi)滴注MSCs還是外源性輸注MSCs都可以減輕機械通氣導致的大鼠肺損傷。MSCs在ALI動物模型中取得了理想的治療效果，但是其機制尚未完全明確。MSCs作為全細胞療法治療肺損傷對于病人可能存在一些風險，并且更多研究表明，MSCs并非主要通過多向分化為肺細胞發(fā)揮作用，因為在恢復的肺臟中很少能找到MSCs來源的肺細胞，說明分化成肺細胞的MSC所占比例很小。還有研究表明經(jīng)過低氧刺激后的骨髓間充質(zhì)干細胞濃縮培養(yǎng)液（MSC-derivedconditionedmedium，MSCsCM）同樣能夠促進肺損傷組織的修復，這種作用可能與角質(zhì)細胞生長因子（Keratinocytegrowthfactor，KGF）的分泌增加有關，因此探討MSCsCM及低氧刺激后的MSCsCM(H+MSCsCM)是否具有同樣治療作用是很有意義的工作。本研究利用機械通氣造成肺損傷大鼠模型，觀察了MSCsCM以及(H+MSCsCM)對肺損傷的治療作用并初步探討了其機制。 研究目的： 觀察MSCsCM以及(H+MSCsCM)對肺損傷的治療作用并初步探討其機制。 實驗方法： 一、骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)和低氧對于骨髓間充質(zhì)干細胞增殖作用的影響： （1）骨髓干細胞的收集培養(yǎng)：成年的雄性SD大鼠斷頸處死SD大鼠后于75%酒精中浸泡5min。用全骨髓貼壁法培養(yǎng)細胞，選取生長狀態(tài)良好的3代內(nèi)細胞進行鑒定。 （2）收集MSCsCM及H+MSCsCM置4℃保存?zhèn)溆谩?（3）以單克隆抗體CD45、CD90行流式細胞術鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的。 （4）低氧對骨髓間充質(zhì)干細胞的影響：用MTT法測定第3代MSCs細胞以及低氧處理的P3代（H+P3）細胞的增殖情況。 二、骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液對于大潮氣量機械通氣導致的大鼠肺損傷的治療作用： （1）VILI模型建立及動物分組：將雄性清潔級SD大鼠隨機均分成：A組：空白對照組，B組：VILI組，C組：MSCsCM治療組，D組：MSCsH+CM組。每組10只。大鼠自發(fā)呼吸30min后，B、C、D三組以呼吸頻率80次/分、潮氣量30ml/kg、呼氣末正壓（PEEP）0cmH2O參數(shù)進行機械通氣3小時制備VILI模型。造模后即刻和之后21小時（即開始實驗后24小時），A、B（陰、陽性）對照組經(jīng)尾靜脈輸注PBS，C、D治療組分別輸注MSCsCM或者H+MSCsCM。 （2）肺損傷指標測定：開始實驗48小時后處死大鼠，取大鼠左肺，測肺濕/干重比值（W/D）并觀察組織病理學變化，檢測肺組織勻漿中MPO值。 （3）肺損傷炎癥因子及KGF表達量測定：制備并測定大鼠右肺支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）中蛋白含量、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）以及角化蛋白生長因子（KGF）的表達水平。 三、MSCsCM及其H+MSCsCM對A549細胞系增殖和遷移能力的影響： （1）收集MSCs及H+MSCs，用熒光定量PCR法檢測KGF的mRNA表達量。 （2）WST-1法測定上清液對A549肺泡上皮細胞的增殖影響。 （3）細胞劃痕實驗測定上清液對A549細胞遷移能力的影響。 實驗結(jié)果： （1）用全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)SD大鼠骨髓MSCs細胞；流式細胞儀檢測顯示：第三代細胞表面MSCs特異性標志CD90表達率為96%，而非MSCs表面標志CD45僅為2.5%。MTT結(jié)果顯示低氧培養(yǎng)下的MSCs比常氧條件下MSCs增殖速率高，并且光鏡下觀察到細胞狀態(tài)均一和折光性更好。 （2）骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液對于大潮氣量機械通氣導致的大鼠肺損傷的治療作用：①成功復制VILI動物模型：病理檢查發(fā)現(xiàn)，VILI組肺組織水腫并有大量炎性細胞浸潤，而對照組肺組織結(jié)構(gòu)接近正常；同時，VILI組大鼠左肺W/D比值、肺組織MPO值、肺泡灌洗液中蛋白含量、TNF-α和IL-6的表達均較對照組明顯升高（P0.05）；在VILI組，肺泡灌洗液中的IL-10和KGF的表達也顯著高于對照組（P0.05）。②MSCsCM和H+MSCsCM對VILI動物模型肺損傷的治療作用：組織病理形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，VILI組肺組織水腫并有大量的炎性細胞浸潤，予MSCsCM和H+MSCsCM處理后可明顯減輕肺組織炎癥，肺組織結(jié)構(gòu)接近正常；同時，，W/D比值MSCsCM組比VILI組降低14.1%，H+MSCsCM組比VILI組降低12.2%（P0.05）。VILI組與對照組相比，MPO活性明顯增加（上升73.21%，P0.01），但MSCsCM組和H+MSCsCM組則較VILI組分別降低59.02%和63.14%（P均0.01）。肺泡灌洗液中蛋白含量MSCsCM組較VILI組降低0.23mg/ml（P0.01），H+MSCsCM組降低0.25mg/m（lP0.01）。③H+MSCsCM和MSCsCM對VILI動物模型BALF中IL-6、TNF-α和IL-10水平的影響：與VILI組相比，MSCsCM組IL-6和TNF-α分別降低了20.07%和34.74%（P均0.05），而H+MSCsCM組則分別降低了23.50%和37.11%（P均0.05）；MSCsCM組IL-10含量較VILI組升高21.16ng/ml，而H+MSCsCM組則升高18.79ng/ml（P均0.05）。④H+MSCsCM和MSCsCM對VILI動物模型肺中KGF的影響：MSCsCM組KGF比VILI組升高16.21pg/ml（P0.01），H+MSCsCM組則升高22.31pg/ml（P0.01）。 （3）體外實驗結(jié)果顯示：MSCsCM和H+MSCsCM均能促進A549細胞的增殖和遷移；低氧刺激MSCs之后KGF的mRNA的表達量增加了一倍（P0.05）。 結(jié)論： （1）用全骨髓貼壁法可以在體外分離、培養(yǎng)出純度較高的SD大鼠來源MSCs，低氧環(huán)境可以刺激MSCs的增殖。 （2）MSCsCM和H+MSCsCM輸注可以減輕VILI造成的肺部損傷和炎癥細胞浸潤； （3）MSCsCM和H+MSCsCM能促進肺泡上皮的增殖和遷移； （4）低氧可以刺激MSCs中KGFmRNA的表達。
【關鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液 急性肺損傷 機械通氣 角化細胞生長因子
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-18
• 文獻回顧18-29
• 實驗一 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng)鑒定及條件培養(yǎng)上清液的收集29-38
• 1 實驗動物、材料與試劑29-31
• 2 實驗方法31-32
• 3 實驗結(jié)果32-35
• 4. 討論35-38
• 實驗二 常氧及低氧條件下骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液對大鼠VILI治療作用及機制初探38-59
• 1 實驗動物、試劑與材料38-41
• 2 實驗方法41-49
• 3 實驗結(jié)果49-56
• 4 討論56-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻60-72
• 個人簡歷和研究成果72-73
• 致謝73-74

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本文編號：488736