本文關(guān)鍵詞：膿毒癥急性肺損傷時HSPA12B對肺血管通透性的影響及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：膿毒癥是臨床上常見的、嚴(yán)重威脅病人生命的感染性綜合征,進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致膿毒癥休克、多器官功能損傷,發(fā)病率及死亡率高。其中,急性肺損傷(ALI)是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一,其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制是肺內(nèi)皮屏障功能障礙,肺血管通透性增加,進(jìn)一步導(dǎo)致肺水腫、嚴(yán)重低氧血癥。肺血管通透性增加是其主要的病理生理特征。因此,保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、維持正常的肺內(nèi)皮屏障功能及肺血管通透性對于ALI的干預(yù)治療具有重要的臨床意義。熱休克蛋白A12B(HSPA12B)是HSP70超家族中的一員,不同于其他熱休克蛋白,它主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,是內(nèi)皮細(xì)胞特異的熱休克蛋白,參與了血管的生成與穩(wěn)定。HSPA12B表達(dá)上調(diào)可以減輕膿毒癥導(dǎo)致的心功能障礙,也可以減輕缺血再灌注時腦組織的損傷。但是,HSPA12B對膿毒癥時肺臟功能有無保護(hù)作用,尤其是對肺內(nèi)皮通透性有無影響及其可能的機制,尚未見研究。本研究通過離體與在體兩大部分實驗,探討膿毒癥時HSPA12B對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及其可能的機制。離體實驗,我們采用脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),研究HSPA12B的表達(dá)變化情況及其發(fā)生變化的可能機制;構(gòu)建HSPA12B高表達(dá)質(zhì)粒,研究HSPA12B高表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響以及其作用機制。在體實驗,我們構(gòu)建CLP小鼠模型,觀察HSPA12B表達(dá)下調(diào)對膿毒癥小鼠肺通透性的影響。第一部分LPS處理HUVEC時HSPA12B的表達(dá)變化及其可能機制目的探討HSPA12B在LPS處理的HUVEC中的表達(dá)變化及其機制。方法1.培養(yǎng)HUVEC,用終濃度為1μg/ml的LPS刺激HUVEC,分別于0h、3h、6h、9h、12h、24h收集細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR法及Western blot法分別檢測HSPA12B的m RNA及蛋白質(zhì)水平。2.培養(yǎng)HUVEC,分別用NF-κB、p38抑制劑(NF-κB inhibitor、SB203580)及其對照試劑DMSO對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,然后用LPS刺激HUVEC,12h后收集細(xì)胞,Western blot法檢測HSPA12B的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果1.LPS處理HUVEC后,HSPA12B m RNA和蛋白質(zhì)水平均在0-12h內(nèi)逐漸升高,12h達(dá)高峰。2.與DMSO相比,使用NF-κB inhibitor、SB203580后可以降低LPS誘導(dǎo)的HSPA12B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)論內(nèi)毒素對HUVEC中HSPA12B表達(dá)具有一定影響,HSPA12B的表達(dá)在0-12h內(nèi)逐漸升高,12h達(dá)高峰,隨后開始下降;LPS誘導(dǎo)的HSPA12B表達(dá)的改變與NF-κB、p38信號通路相關(guān)。第二部分HSPA12B對LPS誘導(dǎo)HUVEC通透性改變的影響目的研究HSPA12B表達(dá)上調(diào)對LPS誘導(dǎo)的HUVEC通透性改變的影響。方法HUVEC分為4組:①control組(未進(jìn)行任何處理);②LPS(1μg/ml)組;③LPS+HSPA12B高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p IRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B);④LPS+陰性對照質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染p IRES2-EGFP-3Flag)。分別進(jìn)行相應(yīng)的處理后,檢測HUVEC的跨內(nèi)皮電阻抗(TEER)值。結(jié)果control組、LPS組、(LPS+HSPA12B高表達(dá))組、(LPS+陰性對照質(zhì)粒)組的TEER值分別為:36±2?、25±1?、28±1?、45±2?。與LPS組和(LPS+陰性對照質(zhì)粒)組比較,HSPA12B高表達(dá)組的TEER值均明顯升高(P0.001)。結(jié)論HSPA12B可以降低LPS刺激下HUVEC的通透性,可能對血管內(nèi)皮屏障功能有保護(hù)作用。第三部分HSPA12B影響HUVEC通透性的可能機制目的探討HSPA12B對LPS刺激下HUVEC通透性的影響機制。方法將HUVEC分為四組:①control組(未進(jìn)行任何處理);②LPS(1μg/ml)組;③LPS+HSPA12B高表達(dá)組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p IRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B);④LPS+陰性對照質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染p IRES2-EGFP-3Flag)。LPS處理12h后收集細(xì)胞,Western blot法檢測粘附分子VE-cadherin、ICAM-1、E-selectin的表達(dá),以及通透性相關(guān)激酶MLC、SRC、cdc42的表達(dá)及其活性;免疫熒光檢測VE-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)果Western blot檢測結(jié)果表明:HUVEC經(jīng)LPS刺激12h后,與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比,HSPA12B高表達(dá)組的粘附分子VE-cadherin表達(dá)水平明顯上調(diào);HSPA12B高表達(dá)組的激酶MLC、SRC、cdc42的表達(dá)也增強,而其活性形式P-MLC、P-SRC、P-CDC42水平并無差異。免疫熒光結(jié)果顯示,HSPA12B高表達(dá)組的VE-cadherin水平也升高。結(jié)論結(jié)合第二部分的實驗結(jié)果,本部分結(jié)果提示:LPS刺激下,HSAP12B可能通過上調(diào)粘附分子VE-cadherin的表達(dá),降低HUVEC的通透性;也可能通過增加血管內(nèi)皮通透性相關(guān)的激酶MLC、SRC、CDC42的表達(dá),降低HUVEC的通透性,從而起到保護(hù)血管內(nèi)皮屏障功能的作用。第四部分HSPA12B對膿毒癥肺損傷小鼠肺通透性的影響目的在體研究HSPA12B表達(dá)下調(diào)對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺通透性的影響。方法實驗小鼠隨機分為四組:sham組、CLP組、NC-CLP組、HSP12B-si RNA-CLP組。小鼠經(jīng)鼻吸入修飾的si RNA納米微粒復(fù)合物,CLP術(shù)后30h,經(jīng)頸外靜脈注射Evans Blue,2h后取肺組織檢測EB染料的含量。結(jié)果肺組織大體觀顯示:較NC-CLP組,HSPA12B-si RNA-CLP組小鼠肺組織明顯變藍(lán)。肺組織Evans藍(lán)的含量檢測結(jié)果顯示,sham組、CLP組、NC-CLP組、HSP12B-si RNA-CLP組小鼠肺組織EBD的含量分別為:10.28±0.72μg/g、12.22±0.37μg/g、11.97±0.79μg/g、15.65±2.36μg/g。與NC-CLP組相比,HSPA12B-si RNA-CLP組小鼠肺組織Evans藍(lán)的含量明顯增多(P0.001)結(jié)論HSPA12B表達(dá)下調(diào)后小鼠肺組織Evans藍(lán)含量明顯增多,表明肺通透性增加,肺血屏障功能受損。提示:膿毒癥急性肺損傷時,HSPA12B高表達(dá)可能可以降低肺通透性,保護(hù)肺血屏障功能。
【關(guān)鍵詞】：熱休克蛋白A12B 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 脂多糖 NF-κB p38 熱休克蛋白A12B 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 脂多糖 跨內(nèi)皮電阻抗 熱休克蛋白A12B 內(nèi)皮通透性 粘附分子 激酶 熱休克蛋白A12B 膿毒癥急性肺損傷 肺通透性
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7;R563

  本文關(guān)鍵詞：膿毒癥急性肺損傷時HSPA12B對肺血管通透性的影響及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：477589