目的:本研究旨在:1.分析比較脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)大鼠肺泡灌洗液(Broncho Alveolar Lavage Fluid,BALF)、脾臟及外周血3種不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞原代提取及培養(yǎng)方法。2、探討亞低溫(Mild Hypothermia,MHT)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(Alveolar Macrophage,AM)Toll樣受體4蛋白及下游促炎介質(zhì)的影響。研究方法:1、采用密度梯度離心法提取LPS誘導(dǎo)的ARDS SD(Sprang-Daley)大鼠BALF、脾臟及外周血中的原代巨噬細(xì)胞,通過(guò)免疫化學(xué)染色的方法對(duì)提取細(xì)胞進(jìn)行鑒定、計(jì)數(shù)及純度計(jì)算,并采用細(xì)胞增殖活性檢測(cè)(Cell Counting Kit-8,CCK-8)試劑盒檢測(cè)三種方法提取的原代巨噬細(xì)胞活性。2、分析亞低溫處理對(duì)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠AM TLR4蛋白及下游促炎介質(zhì)的影響。通過(guò)建立大鼠ARDS模型,分析相關(guān)TLR4、My D88、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factors-α,TNF-α)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)的變化。分別在原代巨噬細(xì)胞中加入濃度為0ug/ml,1ug/ml,5ug/ml,8ug/ml,10ug/ml,15ug/ml的LPS,通過(guò)CCK-8試劑盒對(duì)LPS干預(yù)原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行最適濃度梯度測(cè)定后,使用完全培養(yǎng)基,在溫度37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)原代巨噬細(xì)胞24h后,隨機(jī)將細(xì)胞分為亞低溫組和常溫(Normothermia,NT)組,分別置于32℃和37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每組再隨機(jī)分為L(zhǎng)PS干預(yù)組和磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)對(duì)照組;LPS干預(yù)組加入5g/ml LPS進(jìn)行干預(yù),對(duì)照組加入等量PBS。分別在培養(yǎng)0h、1h、4h、8h、16h及24h提取巨噬細(xì)胞RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α和i NOS m RNA表達(dá)變化;并提取巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和i NOS的表達(dá)變化;在培養(yǎng)1h、4h、8h、16h及24h提取巨噬細(xì)胞總蛋白,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blotting,WB)檢測(cè)巨噬細(xì)胞TLR4和My D88蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:1.肺泡灌洗液、脾臟及外周血三種方法提取的原代巨噬細(xì)胞個(gè)數(shù)均值分別為(1.14±0.14)×106個(gè)、(9.29±0.19)×106個(gè)及(3.17±0.13)×106個(gè),三組間兩兩比較差異有顯著性意義(P0.05);三種方法提取的原代巨噬細(xì)胞的活性比較,肺泡灌洗液提取出的巨噬細(xì)胞顯著高于另2組(P0.05),而脾臟與外周血提取的原代巨噬細(xì)胞差異無(wú)顯著性意義(P0.05);三種方法提取的原代巨噬細(xì)胞通過(guò)免疫化學(xué)檢測(cè),得出細(xì)胞純度分別為(95.779±1.170)%,(94.132±1.412)%,(94.012±0.954)%,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.通過(guò)CCK-8試劑盒對(duì)LPS干預(yù)原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行最適濃度梯度測(cè)定后,得出最適LPS濃度為5ug/ml。3.巨噬細(xì)胞TLR4及My D88蛋白的表達(dá):與常溫組比較,TLR4蛋白表達(dá)量于亞低溫干預(yù)后4h、8h、16h、24h明顯下降(4h:0.376±0.011比0.262±0.032,8h:0.588±0.040比0.390±0.029;16h:0.767±0.013比0.555±0.050,24h:0.493±0.026比0.317±0.031,均P0.05);My D88蛋白于亞低溫干預(yù)后1h、4h、8h、16h明顯下降(1h:0.433±0.016比0.240±0.034,4h:0.524±0.026比0.351±0.020,8h:0.636±0.034比0.395±0.011;16h:0.726±0.008比0.568±0.023,均P0.05)。4.巨噬細(xì)胞TNF-αm RNA、i NOS m RNA表達(dá)(2﹣△△Ct):與常溫組比較,亞低溫組TNF-αm RNA及i NOS m RNA表達(dá)于干預(yù)后1h、4 h、8 h、16 h和24 h明顯下降(TNF-αm RNA:1h:0.802±0.244ng/L比0.366±0.074ng/L,4h:1.644±0.157ng/L比0.771±0.121ng/L,8 h:3.213±0.857ng/L比2.007±0.690ng/L,16 h:7.916±2.292ng/L比3.944±0.447ng/L,24 h:4.116±1.340ng/L比2.517±1.165ng/L;i NOSm RNA:1h:0.679±0.147ng/L比0.366±0.129ng/L,4h:1.170±0.148ng/L比0.797±0.101ng/L,8 h:2.403±0.307ng/L比1.193±0.097ng/L,16 h:4.986±1.131ng/L比3.252±0.768ng/L,24 h:8.867±1.395ng/L比4.529±1.395ng/L,均P0.05)。5.巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、i NOS炎癥介質(zhì)的表達(dá):與常溫組比較,亞低溫組TNF-α表達(dá)于干預(yù)后4 h、8 h、16 h和24 h明顯下降、i NOS表達(dá)于干預(yù)后1h、4 h、8 h、16 h和24 h明顯下降(TNF-α:4h:128.859±23.667ng/L比48.784±7.627ng/L,8 h:214.136±14.460ng/L比110.594±5.957ng/L,16 h:390.949±5.789ng/L比216.305±11.229ng/L,24 h:600.659±9.415ng/L比348.981±15.844ng/L;i NOS m RNA:1h:84.297±0.582ng/L比64.798±5.479ng/L,4h:134.043±6.205ng/L比71.458±3.866ng/L,8 h:285.510±69.423ng/L比133.124±34.114ng/L,16 h:737.387±160.174ng/L比304.097±51.948ng/L,24 h:431.907±42.335ng/L比237.965±8.985ng/L,均P0.05)。結(jié)論:1、三種方法提取的原代巨噬細(xì)胞相較,巨噬細(xì)胞純度差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,肺泡灌洗液提取的原代巨噬細(xì)胞活性最強(qiáng),脾臟提取的原代巨噬細(xì)胞數(shù)量最多,外周血提取的原代巨噬細(xì)胞活性及數(shù)量介于兩者之間。2、亞低溫下調(diào)LPS誘導(dǎo)ARDS大鼠肺泡灌洗液巨噬細(xì)胞TLR4/My D88信號(hào)通路,從而抑制炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R563.8
【部分圖文】：

and DAPI nuclear staining（10×）4. CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果表明（表1-1，圖1-3），3組所獲取的原代細(xì)胞活性比較，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺泡灌洗液提取的原代巨噬細(xì)胞檢測(cè)出的吸光度值均顯著高于其他2個(gè)培養(yǎng)組，差異均有顯著性意義(P < 0.05)，肺泡灌洗液提取的原代巨噬細(xì)胞活性最高，脾臟組織及外周血提取出的原代巨噬細(xì)胞活性差別在1 h與1.5 h無(wú)顯著性意義(P > 0.05)，在0.5 h與2 h組差異均有顯著性意義(P <0.05)；3個(gè)培養(yǎng)組與空白組之間兩兩比較，差異均有顯著性意義(P < 0.05)。

濃度（ug/ml）時(shí)間（h）0.5 1 1.5 20 0.127±0.006 0.345±0.025a0.392±0.017a0.558±0.031 0.350±0.027a0.446±0.014a0.425±0.040a0.608±0.005 0.460±0.022a0.507±0.048a0.798±0.059ab1.066±0.058 0.462±0.032a0.512±0.048a0.705±0.131a1.020±0.0110 0.322±0.014a0.383±0.062a0.417±0.009a0.771±0.0215 0.200±0.077 0.250±0.041 0.380±0.037a0.764±0.03空白對(duì)照組 0.141±0.021 0.197±0.017 0.212±0.016 0.264±0.0F 63.634 37.211 47.956 284.67P 0.000 0.000 0.000 0.000表注：與空白對(duì)照組相比，aP<0.05； 5ug/ml、8ug/ml 兩組間相比bP <0.05；LPS 濃度為 5ug/ml、8ug/ml 兩組的 OD 值與其他組相同時(shí)間相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P <0.05）;而在其他相同時(shí)間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。H

低溫對(duì)急性呼吸性窘迫綜合征大鼠肺泡巨噬細(xì)胞 Toll 樣受體 4 蛋白及下游促炎介質(zhì)的影響 2019 屆碩士學(xué)位論文結(jié) 果1. RT-PCR 檢測(cè)巨噬細(xì)胞中 TNF- （圖 2-2；表 2-7）和 iNOS（圖 2表 2-8）的 mRNA 表達(dá)首先進(jìn)行 PCR 反應(yīng)檢測(cè) iNOS 及 TNF- 電泳擴(kuò)增片段（圖 2-1）。亞對(duì)照組和常溫對(duì)照組中 TNF- 及 iNOS 的 mRNA 表達(dá)沒(méi)有顯著變化，亞干預(yù)組和常溫干預(yù)組首先隨時(shí)間變化逐漸增加，16h 達(dá)高峰，然后逐漸下預(yù)組 1h 后亞低溫組 TNF- 和 iNOS mRNA 表達(dá)明顯低于常溫組（P <0.0低溫組 TNF- 和 iNOSmRNA 表達(dá)水平顯著低于常溫組（P <0.05）。
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本文編號(hào)：2865331