背景和目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brian injury,TBI)是威脅人類生命的重大疾病,具有高致殘、致死特點,目前尚缺乏有效的藥物干預手段。TBI病理生理機制復雜,繼發(fā)的凝血功能障礙(TBI associated coagulopathy,TBI-AC)及血腦屏障破壞被認為與其不良預后相關。前期研究發(fā)現(xiàn),TBI急性期粘附配體血管性血友病因子(von Willibrand factor,VWF)水平升高且粘附活性增強,通過與腦源性微囊泡(brain-derived microvesicles,BDMVs)結合,協(xié)助BDMVs破壞血腦屏障及引起TBI-AC。有研究證明純化的VWF-A2片段可抑制血小板與VWF以及血小板與纖維蛋白的相互作用。本研究擬通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、表達、純化獲得高純度重組VWF-A2蛋白,腹腔注射干預TBI小鼠。探索VWF-A2對TBI小鼠血腦屏障及凝血系統(tǒng)的影響,同時探索其可能的作用機制,為TBI患者藥物治療提供新思路。方法:(1)通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、表達、純化獲得重組VWF-A2蛋白(組氨酸標簽標記)。通過凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡法及金屬酶ADAMTS-13體外酶切實驗對VWF-A2進行鑒定和初步功能性研究。(2)通過液壓打擊儀制備C57BL/6J小鼠重型TBI模型,傷后30 min腹腔注射VWF-A2(4 mg/kg),檢測不同時間點VWF-A2循環(huán)血濃度。評估VWF-A2對TBI小鼠傷后3天內(nèi)死亡率的影響,改良版神經(jīng)功能評分評估神經(jīng)功能預后。(3)伊文氏藍滲漏實驗檢測TBI小鼠血腦屏障通透性。蘇木精-伊紅染色評估TBI小鼠肺組織血管滲出情況。流式細胞術檢測循環(huán)血MVs水平。Transwell小室系統(tǒng)和免疫熒光染色技術檢測VWF-A2對TBI小鼠外周血源性MVs及體外凍融勻漿法制備的BDMVs介導的內(nèi)皮屏障破壞的影響。(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測TBI小鼠循環(huán)血VWF抗原、D-二聚體和纖維蛋白原含量及VWF結合膠原能力。磷鎢酸-蘇木精染色評估TBI小鼠腎臟纖維素沉積情況。凝血酶生成實驗和活化凝血因子X凝血時間檢測MVs介導的凝血反應。流式細胞儀和血細胞計數(shù)儀檢測血小板激活水平及血小板計數(shù)。小鼠斷尾流血時間檢測TBI小鼠出血傾向。(5)免疫共沉淀法及表面等離子體共振技術檢測TBI小鼠循環(huán)血及體外VWF與VWF-A2相互作用。同時評估VWF-A2對瑞斯托霉素輔因子活性和剪切力誘導的血小板聚集的影響。結果:通過VWF-A2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、表達、純化成功獲得大量高純度重組VWF-A2蛋白(純度90-95%),金屬酶ADAMTS-13可有效酶切VWF-A2,證明了其具有生物學活性。VWF-A2可減少TBI后循環(huán)血中攜帶VWF的腦源性、血小板源性及內(nèi)皮細胞源性MVs釋放,抑制VWF協(xié)助下BDMVs介導的血腦屏障破壞及內(nèi)皮細胞激活,同時降低了TBI小鼠死亡率,改善存活小鼠神經(jīng)功能預后。同時,VWF-A2可減少TBI后高活性VWF的釋放并能抑制其粘附活性,減輕VWF引起的血小板激活及血小板減少癥。此外,VWF-A2對凝血及纖溶級聯(lián)反應也有抑制作用,表現(xiàn)為減輕了MVs介導的凝血酶生成及活化凝血因子Xa凝血反應,D-dimer水平下降,纖維蛋白原水平上升,并且緩解了TBI后出血傾向但不引起正常老鼠出血傾向。最后,通過體內(nèi)、體外實驗證實VWF-A2可結合到活化VWF暴露的A1結構域,抑制其活性,表現(xiàn)為減輕瑞斯托霉素或剪切力誘導的血小板聚集。結論:本研究成功純化重組VWF-A2蛋白,證明VWF-A2可減輕TBI小鼠血腦屏障及凝血系統(tǒng)損害,降低死亡率,改善神經(jīng)功能預后。其神經(jīng)保護機制可能是結合并抑制了TBI后釋放的高活性VWF功能,提示了其作為藥物開發(fā)的可行性,為TBI藥物治療提供新思路。同時,VWF-A2還可能成為特異性檢測高活性VWF的新手段,用于診斷血栓性血小板減少性紫癜、嚴重感染等疾病。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

MVs 經(jīng)鼠尾靜脈注入正常 C57BL/6J 小鼠，小鼠表現(xiàn)出與遭受 TBI狀態(tài)。同時，血腦屏障及肺組織微血管完整性均遭到了破壞，隨實 BDMVs 可在血小板協(xié)助下介導內(nèi)皮細胞激活和內(nèi)皮屏障的破壞等[13]通過乳凝集素（Lactadherin，LAC）清除 TBI 小鼠循環(huán)血 MI 后血腦屏障破壞和高凝血狀態(tài)得到了明顯改善。Wu 等[14]研究發(fā)友病因子（von Willibrand factor，VWF）在 TBI 后大量釋放，其粘并能與 BDMVs 結合，協(xié)助 BDMVs 引起內(nèi)皮損傷和 TBI-AC。綜圖見圖 1）：VWF 協(xié)助 BDMVs 破壞血腦屏障，進入外周同時激活細胞，并產(chǎn)生血小板和內(nèi)皮細胞來源的 MVs，這些 MVs 同樣攜帶表面 TF 可啟動外源性凝血途徑，進而啟動內(nèi)源性凝血途徑，而 PS應提供了磷脂表面，加上 TBI 后結合到 MVs 上的 VWF，這使循大量的移動“凝血平臺”，造成系統(tǒng)性高凝狀態(tài)，并迅速進展為消。這就解釋了單純 TBI 造成的局部損傷是如何播散而引發(fā)早期全和高纖溶狀態(tài)的。

后在高爾基體中通過 N 端二硫鍵形成多聚體。在糖基化和裂解去成熟 VWF[16-18]。多數(shù) VWF 在正常生理情況下釋放入血，少數(shù)胞的 Weibel-Palade 顆粒和血小板的 α-顆粒中，形成具有高度促血超大 VWF（Ultralarge VWF, ULVWF），分子量 500-20000 kDa，在內(nèi)皮細胞或血小板釋放[19, 20]。循環(huán)血中 VWF 折疊成球形，僅 V暴露便于與膠原結合。而與之相反，VWF-A1 和 VWF-A2 結構域球形結構中，避免生理情況下捕獲、激活血小板（GPIbα-VWF-A ADAMTS-13（a disintegrin and metalloprotease with thrombospond 13）切割（VWF-A2 結構域內(nèi) Tyr1605-Met160 間肽鍵）[21, 22]。，ULVWF 釋放入血，形成螺旋狀長鏈結構通過 VWF-A3 結構域錨原，此時 VWF-A1 與 VWF-A2 的結合被打破，暴露功能位點：V血小板粘附、激活及聚集，而 VWF-A2 則可被金屬酶 ADAMTS-1過度的促血栓形成活動。生理狀態(tài)下，ULVWF 的分泌與裂解處于，當 VWF 異常增多或 ADAMTS-13 減少時，機體易發(fā)生凝血功能紊]。

1.1.1A：LB 固態(tài)培養(yǎng)皿，內(nèi)含單個細菌菌落。B：滅菌槍頭挑取單個菌中振蕩培養(yǎng)。C：超聲破碎后菌液。 將上述 2 mL 菌液置于 1 LLB 選擇培養(yǎng)基（含抗生素）中，繼續(xù)m/s 振蕩培養(yǎng)數(shù)小時。 取 1mL 菌液于酶標儀專用檢測管中，600 nm 波長處檢測吸光度（如達不到，則繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)經(jīng)驗，培養(yǎng) 6 h 后可達到目標吸光度4 VWF-A2 蛋白誘導表達吸光度達標后，向 1 L 菌液中加入終濃度為 0.5mM 的 IPTG，于 4 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h 以誘導目標蛋白 VWF-A2 的表達。5 冰浴超聲破菌 72 h 后，將菌液置于 400 mL 離心瓶中 4 ℃下 6000 rpm 離心 10 m25 mLPBS 緩沖液（pH 7.4）重懸菌體并轉(zhuǎn)移至鋁制超聲破碎瓶中超聲破碎，超聲破碎儀參數(shù)為：恒定功率 300 W，工作 3 s，間隔 。超聲破碎時應注意探頭不能觸碰鋁瓶瓶底或側(cè)壁，以免損壞機器
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本文編號：2865088