本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞骨架重塑在機(jī)械牽伸誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞分化過程中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：體內(nèi)的肌腱由于經(jīng)常承受著巨大的力學(xué)載荷,損傷是很常見的。由于肌腱自身再生能力較差,恢復(fù)損傷肌腱正常的結(jié)構(gòu)和功能是運(yùn)動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前最具挑戰(zhàn)的一個問題。隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),特別是近年來肌腱干細(xì)胞(tendon stem cells,TSCs)的發(fā)現(xiàn),研究者對慢性肌腱損傷的發(fā)病機(jī)制和肌腱損傷的治療修復(fù)有了新的認(rèn)識。和肌腱一樣,位于其內(nèi)部的TSCs也必然會承受各種力學(xué)負(fù)荷。一項(xiàng)體外研究發(fā)現(xiàn):TSCs的分化與加載的力學(xué)負(fù)荷強(qiáng)度相關(guān):適度的力學(xué)牽拉牽伸刺激可以促進(jìn)TSCs向肌腱細(xì)胞分化;過度的力學(xué)牽伸刺激則會導(dǎo)致TSCs向非肌腱細(xì)胞(脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞)方向分化。然而,TSCs成肌腱和非成肌腱細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。不同的機(jī)械牽伸可以導(dǎo)致TSCs發(fā)生不同的形變。維持細(xì)胞形態(tài)對細(xì)胞的功能至關(guān)重要,而維持細(xì)胞形態(tài)的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)是細(xì)胞骨架。細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)部緊密聯(lián)系的不同蛋白纖維和各種調(diào)控蛋白構(gòu)成的網(wǎng)架體系,對細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)起到支撐作用,在細(xì)胞伸展、生長、對外界環(huán)境反應(yīng)以及分化等生理過程中,均扮演著極其重要的角色。目前,人們對于細(xì)胞力學(xué)信號傳導(dǎo)的分子機(jī)制仍然缺乏較深入的認(rèn)識,但是有一個普遍認(rèn)同的事實(shí)就是:細(xì)胞骨架在建立細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的物理-化學(xué)信號聯(lián)系及轉(zhuǎn)換上起著至關(guān)重要的作用�；谏鲜龌A(chǔ),我們推測在機(jī)械牽伸誘導(dǎo)的TSCs分化過程中細(xì)胞骨架重塑可能發(fā)揮了重要的作用,不同的機(jī)械牽伸導(dǎo)致TSCs細(xì)胞骨架發(fā)生了不同的變化,進(jìn)而誘導(dǎo)TSCs向不同的方向分化。因此,本研究將試圖明確不同機(jī)械牽伸對TSCs分化及細(xì)胞骨架的影響,以及細(xì)胞骨架變化在牽拉誘導(dǎo)分化這一過程中的作用。目的:⑴驗(yàn)證明確不同機(jī)械牽伸對TSCs分化的影響;⑵觀察不同機(jī)械牽伸對TSCs細(xì)胞骨架重塑的影響;⑶探討分析細(xì)胞骨架變化在牽拉誘導(dǎo)TSCs分化過程中的作用。方法:⑴不同機(jī)械牽伸對TSCs分化的影響:設(shè)定不同的機(jī)械牽伸條件(1HZ;牽伸強(qiáng)度為4%和8%;牽伸累積總時間為12h,24h,60h),模擬tscs體內(nèi)單軸循環(huán)牽伸,通過rt-pcr技術(shù)對牽伸后tscs成腱分化相關(guān)標(biāo)志基因(colla1、tnc、scx)和成脂分化相關(guān)標(biāo)志基因(pparγ、lpl、ap2)的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。⑵不同機(jī)械牽伸對tscs細(xì)胞骨架重塑的影響:設(shè)定不同的機(jī)械牽伸條件(1hz;牽伸強(qiáng)度為4%和8%;牽伸累積總時間為12h,24h,60h),模擬tscs體內(nèi)單軸循環(huán)牽伸,將牽伸后的細(xì)胞制作成細(xì)胞爬片,采用f-actin免疫熒光染色以及westernblot檢測f-actin/g-actin比值來觀察不同牽伸條件下tscs細(xì)胞骨架的變化。⑶抑制細(xì)胞骨架重塑對tscs分化的影響:篩選出cyt-d的適用濃度,在tscs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)、成肌腱誘導(dǎo)牽伸,以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中,加入cyt-d抑制肌動蛋白聚合,破壞細(xì)胞骨架的重塑,通過定量rt-pcr和westernblot技術(shù)對cyt-d干擾后tscs成脂和成腱分化相關(guān)標(biāo)志基因、蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。結(jié)果:⑴colla1、tnc、scx基因mrna的表達(dá)在頻率1hz,4%的牽拉應(yīng)力載荷時,三個牽拉累積總時間點(diǎn)均增加(p0.05);而8%的牽拉應(yīng)力載荷初期(12h)可使上述基因的mrna表達(dá)略有增加,但隨著牽拉累積時間的延長(60h),上述基因的mrna表達(dá)明顯降低(p0.05)。pparγ、lpl、ap2基因mrna的表達(dá)在頻率1hz,4%的牽拉應(yīng)力載荷早期(12h,24h)無明顯變化,但隨著牽拉累積時間的延長(60h),上述基因的mrna表達(dá)明顯降低(p0.05);而8%的牽拉應(yīng)力載荷則是均導(dǎo)致pparγ、lpl、ap2基因mrna的表達(dá)上升(p0.05)。⑵4%的牽拉應(yīng)力載荷時,相比較于對照組,tscs的細(xì)胞骨架f-actin增粗,熒光增強(qiáng),f-actin/g-actin比值增加(p0.05),且在一定的增加范圍內(nèi)可以與牽伸時間呈正相關(guān)。而8%的過度牽拉應(yīng)力,牽伸12h時,表現(xiàn)為細(xì)胞骨架f-actin熒光增強(qiáng),f-actin/g-actin比值增大,但是細(xì)胞骨架f-actin的伸展性較對照組有所降低;隨著總累積牽拉時間的增加(24h、60h),細(xì)胞骨架f-actin熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?細(xì)胞伸展性明顯減小,變圓,f-actin/g-actin比值也明顯下降(p0.05)。⑶cyt-d可以有效的抑制細(xì)胞骨架肌動蛋白的聚合。在tscs成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng),以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中,使用cyt-d抑制細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合會促使pparγ、lpl、ap2的mrna表達(dá)上升(p0.05);而在tscs成肌腱誘導(dǎo)牽伸,以及普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中,使用cyt-d抑制細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合colla1、tnc、scx的mrna表達(dá)降低(p0.05)。結(jié)論：⑴不同的牽伸條件可使TSCs傾向于不同的系譜方向分化:適度的機(jī)械牽拉載荷促使TSCs傾向于成腱分化,而過度的機(jī)械牽拉載荷促使TSCs傾向于成脂分化。⑵不同的牽伸條件會導(dǎo)致細(xì)胞骨架出現(xiàn)不同的重塑適度的機(jī)械牽拉載荷促使TSCs細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合增加,而過度的機(jī)械牽拉載荷則會導(dǎo)致TSCs細(xì)胞骨架F-actin斷裂、解聚。⑶抑制細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合會促進(jìn)TSCs成脂分化,并導(dǎo)致適度機(jī)械牽伸對TSCs成腱分化的誘導(dǎo)效應(yīng)消失,抑制TSCs成肌腱細(xì)胞分化。⑷在機(jī)械牽伸誘導(dǎo)的TSCs分化過程中,細(xì)胞骨架的變化起著非常重要的作用,它不是伴隨著TSCs成脂肪細(xì)胞或成肌腱細(xì)胞分化出現(xiàn)的一個結(jié)果,而是調(diào)控TSCs向不同終末細(xì)胞方向分化的早期細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)信號之一。該研究不僅僅有利于我們進(jìn)一步認(rèn)識機(jī)械牽拉對于TSCs分化方向的調(diào)控,而且對于探索機(jī)械拉伸誘導(dǎo)TSCs分化過程中力學(xué)信號傳導(dǎo)機(jī)制具有重要意義,為有效的激活肌腱干細(xì)胞向指定終末細(xì)胞方向分化提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ),最終使TSCs能夠成功的應(yīng)用于臨床肌腱病的預(yù)防、肌腱損傷的治療。
【關(guān)鍵詞】：肌腱病 肌腱損傷 肌腱干細(xì)胞 機(jī)械牽伸 分化 細(xì)胞骨架
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R686.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 研究意義16
• 1.3 研究內(nèi)容16-17
• 1.4 研究方法17-18
• 第二章 不同機(jī)械牽伸對TSCs分化的影響18-29
• 2.1 引言18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-26
• 2.5 分析討論26-28
• 2.6 本章小節(jié)28-29
• 第三章 不同機(jī)械牽伸對TSCs細(xì)胞骨架重塑的影響29-41
• 3.1 引言29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-37
• 3.5 分析討論37-40
• 3.6 本章小節(jié)40-41
• 第四章 抑制細(xì)胞骨架重塑對TSCs分化的影響41-58
• 4.1 引言41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料41-43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 4.5 分析討論55-57
• 4.6 本章小節(jié)57-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 文獻(xiàn)綜述 干細(xì)胞治療肌腱損傷的研究進(jìn)展65-78
• 參考文獻(xiàn)72-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果78-79
• 致謝79

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本文編號：279738