本文關(guān)鍵詞：基于脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝臟是人體內(nèi)最大的器官，是物質(zhì)代謝的中樞，在葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白合成以及解毒方面都發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)前肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病正嚴重威脅著人類健康，全世界由肝疾病引發(fā)的死亡率達到2.5%，其中最嚴重的是肝功能衰竭。我國是世界上病毒性肝炎和肝癌發(fā)病人數(shù)最多的國家，每年因肝病死亡的人數(shù)近50萬，每年用于治療肝炎和肝病的醫(yī)療、保健費用高達1000多億元。急性肝功能衰竭預(yù)后不良，死亡率高達70%～80%。目前，針對急、慢性肝衰竭患者，肝移植是最有效的治療方法，但由于可供移植的肝臟嚴重短缺，大多數(shù)患者在等待供體肝臟的過程中死亡。因此，尋找新的療法或肝臟功能替代品已成為臨床上亟需解決的問題，采用肝臟組織工程技術(shù)體外再造肝臟，有望為肝衰竭提供新的治療手段。 組織工程是將工程學(xué)、材料學(xué)與生命科學(xué)的原則應(yīng)用到開發(fā)生物代替物的前沿交叉學(xué)科領(lǐng)域，其核心內(nèi)容是建立三維復(fù)合體，即體外構(gòu)建具有生物學(xué)功能的工程化組織。肝臟組織工程研究始終是組織工程研究的熱點領(lǐng)域之一，在近三十年的發(fā)展過程中，已取得了諸多突破性進展。研究表明，體外再造肝臟具有一定的肝衰竭等肝臟疾病治療作用，系列核心技術(shù)在生物人工肝效能提升與更新?lián)Q代方面發(fā)揮了重要作用。盡管如此，由于肝臟結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性，體外構(gòu)建組織工程化肝臟器官仍面臨著一系列挑戰(zhàn)，如支架材料相容性差，且支架材料中缺乏類似于在體的脈管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致再造肝臟體積受限；此外，現(xiàn)有的支架材料結(jié)構(gòu)和組分相對單一，尚不能為肝細胞提供與體內(nèi)環(huán)境類似的微環(huán)境。正因如此，近年來，基于脫細胞基質(zhì)生物材料的肝臟組織工程研究受到了越來越多的關(guān)注，發(fā)展異常迅速，并取得了一批階段性研究成果。 脫細胞基質(zhì)是指利用化學(xué)法、物理法或酶解法來破壞組織/器官中的細胞結(jié)構(gòu)，并將細胞碎片從細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）中清除而獲得的生物支架材料。利用不同洗脫條件處理后的脫細胞基質(zhì)不僅可以保留組織或器官中的主要細胞外基質(zhì)成分，而且可以使其中的血管系統(tǒng)及超微結(jié)構(gòu)的完整性得到一定保存，因此是一種適應(yīng)細胞生長和組織再生的優(yōu)良材料。脫細胞技術(shù)的迅猛發(fā)展掀起了脫細胞基質(zhì)的研究熱潮。自從2008年Ott等人首次成功制備出心臟全器官脫細胞基質(zhì)以來，研究人員已成功獲得了多種臟器的全器官脫細胞基質(zhì)，如肝臟、腎臟、肺臟等。肝臟作為機體最大的臟器，，基于脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究已成為組織工程研究領(lǐng)域的焦點之一。目前，用于肝臟組織工程研究的脫細胞基質(zhì)支架材料主要包括兩類：非肝臟來源的脫細胞基質(zhì)材料和肝臟來源的全器官脫細胞基質(zhì)材料。 在基于非肝臟脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，為了拓寬支架材料的來源，國內(nèi)外研究人員致力于探索其他組織來源的非肝臟脫細胞基質(zhì)材料應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性。例如，研究人員已成功利用空腸脫細胞基質(zhì)材料構(gòu)建了工程化類肝組織，研究發(fā)現(xiàn)空腸脫細胞基質(zhì)材料能夠支持肝細胞正常的形態(tài)及其代謝活性，表明非肝臟來源的脫細胞基質(zhì)材料能夠應(yīng)用于肝臟組織工程研究。目前，研究其他組織來源的脫細胞基質(zhì)材料對肝細胞的支持作用或構(gòu)建工程化肝臟組織已為成本領(lǐng)域的研究熱點之一。 大網(wǎng)膜（greater omentum）是連接胃大彎至橫結(jié)腸的腹膜，富有極強的彈性和靈活性，同時具有高度血管化的結(jié)構(gòu)，這些特點使其成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中優(yōu)良的天然材料。目前，大網(wǎng)膜在臨床上主要用于外科重建手術(shù)中對炎性或者缺損組織的修復(fù)，促進組織的再生；在組織工程研究領(lǐng)域，大網(wǎng)膜可作為體外移植構(gòu)建物的天然生物反應(yīng)器，促進構(gòu)建物血管化的形成，增強移植構(gòu)建物的功能，已成功應(yīng)用于心肌組織工程、軟骨組織工程、神經(jīng)組織工程等領(lǐng)域。近年來，隨著脫細胞技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員在大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)研究中開展了大量研究工作，并成功獲得了大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架材料，然而，目前尚未見將大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)應(yīng)用于肝臟組織工程的研究報道。 在基于肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，研究人員已經(jīng)應(yīng)用胎兒肝細胞、原代肝細胞、肝細胞系等多種來源的細胞接種到肝臟脫細胞基質(zhì)中，成功在體外構(gòu)建了具有一定功能的工程化肝臟組織或類器官。研究發(fā)現(xiàn)，與以往的支架材料相比，肝臟脫細胞基質(zhì)能夠為細胞提供更接近于天然肝臟的微環(huán)境。此外，由于細胞外基質(zhì)成分在不同的物種之間具有高度保守性，脫細胞技術(shù)得到的細胞外基質(zhì)支架同時具有低免疫原性的優(yōu)點，因而可以作為工程化肝臟組織構(gòu)建中優(yōu)良的生物支架材料。 獲得結(jié)構(gòu)及組成均優(yōu)良的肝臟脫細胞基質(zhì)材料是開展基于脫細胞基質(zhì)肝臟組織工程研究的基礎(chǔ)與前提。目前，肝臟脫細胞基質(zhì)制備方法主要包括物理法、化學(xué)法、酶學(xué)消化法以及上述方法的組合使用等。然而，雖然脫細胞技術(shù)的發(fā)展日新月異，涌現(xiàn)了許多脫細胞方法，但現(xiàn)有脫細胞洗脫方法均存在一定的不足，比如洗脫時間長、ECM成分破壞嚴重、生長因子大量丟失等。理想的制備肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的方法尚有待進一步優(yōu)化。 基于上述分析，本論文主要從以下三個方面開展研究工作： 第一部分：基于大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究 目的：研究大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架材料的成分組成、生物相容性及其應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性。方法：利用免疫組織化學(xué)染色檢測四種大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)（No.1、2、3、4）的組成，通過掃描電鏡檢測其形態(tài)與孔徑大�。辉诖嘶A(chǔ)上，分別接種大鼠原代分離的肝細胞構(gòu)建工程化肝臟組織片層，并進行肝臟組織工程研究，不同時間點取材，通過Live/Dead染色檢測細胞活性，利用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測工程化組織中肝細胞形態(tài)及生物學(xué)功能。結(jié)果：四種大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)均含有天然ECM中主要蛋白組分并具有典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中No.1、3基質(zhì)孔徑較小，No.2、4基質(zhì)孔徑較大；肝臟組織工程研究發(fā)現(xiàn)，與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)支架可以更好的支持肝細胞的粘附、生長及支持其糖原儲存、白蛋白分泌等生物學(xué)功能的發(fā)揮。結(jié)論：大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)作為一種優(yōu)良的生物支架材料，能夠維持肝細胞的形態(tài)并支持其生物學(xué)功能，在肝臟組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。 第二部分：肝臟全器官脫細胞支架材料的制備及條件優(yōu)化 目的：對兩種肝臟全器官脫細胞基質(zhì)制備方法進行比較，以期篩選出更為有效的肝臟脫細胞基質(zhì)制備方法。方法：采用兩種不同方案（分別以十二烷基硫酸鈉（SDS）和Triton X-100+SDS（Tx+SDS）為主要洗滌劑）制備肝臟全器官脫細胞基質(zhì)，通過組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法檢測基質(zhì)中細胞和核酸成分的去除情況、ECM蛋白組成及生長因子含量。結(jié)果：兩種方法均能達到去細胞化要求；SDS方案得到的脫細胞基質(zhì)脈管網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散；Tx+SDS方案得到的脫細胞基質(zhì)脈管結(jié)構(gòu)完整，ECM蛋白和生長因子含量均高于SDS方案。結(jié)論：利用Tx+SDS為主要洗滌的脫細胞方法可成功制備出優(yōu)良的肝臟全器官脫細胞基質(zhì)，為工程化肝臟組織構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：基于肝臟全器官脫細胞支架材料的肝臟組織工程研究 目的：探索以本研究中制備的肝臟全器官脫細胞基質(zhì)為支架材料，構(gòu)建工程化肝臟組織的可行性。方法：以Tx+SDS方案制備肝臟脫細胞基質(zhì)，接種HepG2細胞系構(gòu)建工程化肝組織片層，體外培養(yǎng)7天后取材，利用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、PAS染色研究工程化肝組織的形態(tài)及其生物學(xué)功能。結(jié)果：組織學(xué)染色結(jié)果表明，肝臟脫細胞基質(zhì)支架可以支持細胞的粘附、生長，維持細胞形態(tài)和增殖能力；PAS染色結(jié)果顯示此支架材料能夠支持細胞糖原儲存生物學(xué)功能的發(fā)揮。結(jié)論：Tx+SDS方法制備的肝臟全器官脫細胞支架材料具有良好的生物相容性，可維持細胞形態(tài)并支持其生物學(xué)功能，能夠作為工程化肝臟組織構(gòu)建的優(yōu)良支架材料。 綜上所述，本論文在基于非肝臟來源脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，系統(tǒng)比較了四種具有大小兩類不同孔徑的大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)的成分組成，發(fā)現(xiàn)四種大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)均良好的保留有天然ECM主要蛋白成分且具有良好的生物相容性；與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)能夠更好的維持肝細胞形態(tài)并支持其糖原儲存、白蛋白分泌等生物學(xué)功能的發(fā)揮，證實了大網(wǎng)膜脫細胞基質(zhì)應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性，拓展了肝臟組織工程中脫細胞基質(zhì)支架材料的來源。在基于肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，本論文首先比較研究了兩種制備肝臟全器官脫細胞基質(zhì)的洗脫方案，研究發(fā)現(xiàn)與SDS方案相比，Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質(zhì)可以保留天然肝臟的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、脈管結(jié)構(gòu)完整性，并能更好的保留ECM基本組分。其次，以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質(zhì)為支架材料構(gòu)建工程化肝臟組織，發(fā)現(xiàn)工程化組織中細胞能夠維持良好的形態(tài)并能夠發(fā)揮生物學(xué)功能，表明以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細胞基質(zhì)具有良好的生物學(xué)性能，能夠作為工程化肝臟組織構(gòu)建優(yōu)良的支架材料。上述基于脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究有望為肝衰竭未來的臨床治療提供新的策略與手段。

  本文關(guān)鍵詞：基于脫細胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。