本文關(guān)鍵詞：基于脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝臟是人體內(nèi)最大的器官，是物質(zhì)代謝的中樞，在葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白合成以及解毒方面都發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)前肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病正嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，全世界由肝疾病引發(fā)的死亡率達(dá)到2.5%，其中最嚴(yán)重的是肝功能衰竭。我國(guó)是世界上病毒性肝炎和肝癌發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家，每年因肝病死亡的人數(shù)近50萬(wàn)，每年用于治療肝炎和肝病的醫(yī)療、保健費(fèi)用高達(dá)1000多億元。急性肝功能衰竭預(yù)后不良，死亡率高達(dá)70%～80%。目前，針對(duì)急、慢性肝衰竭患者，肝移植是最有效的治療方法，但由于可供移植的肝臟嚴(yán)重短缺，大多數(shù)患者在等待供體肝臟的過(guò)程中死亡。因此，尋找新的療法或肝臟功能替代品已成為臨床上亟需解決的問(wèn)題，采用肝臟組織工程技術(shù)體外再造肝臟，有望為肝衰竭提供新的治療手段。 組織工程是將工程學(xué)、材料學(xué)與生命科學(xué)的原則應(yīng)用到開(kāi)發(fā)生物代替物的前沿交叉學(xué)科領(lǐng)域，其核心內(nèi)容是建立三維復(fù)合體，即體外構(gòu)建具有生物學(xué)功能的工程化組織。肝臟組織工程研究始終是組織工程研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，在近三十年的發(fā)展過(guò)程中，已取得了諸多突破性進(jìn)展。研究表明，體外再造肝臟具有一定的肝衰竭等肝臟疾病治療作用，系列核心技術(shù)在生物人工肝效能提升與更新?lián)Q代方面發(fā)揮了重要作用。盡管如此，由于肝臟結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性，體外構(gòu)建組織工程化肝臟器官仍面臨著一系列挑戰(zhàn)，如支架材料相容性差，且支架材料中缺乏類(lèi)似于在體的脈管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致再造肝臟體積受限；此外，現(xiàn)有的支架材料結(jié)構(gòu)和組分相對(duì)單一，尚不能為肝細(xì)胞提供與體內(nèi)環(huán)境類(lèi)似的微環(huán)境。正因如此，近年來(lái)，基于脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的肝臟組織工程研究受到了越來(lái)越多的關(guān)注，發(fā)展異常迅速，并取得了一批階段性研究成果。 脫細(xì)胞基質(zhì)是指利用化學(xué)法、物理法或酶解法來(lái)破壞組織/器官中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并將細(xì)胞碎片從細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）中清除而獲得的生物支架材料。利用不同洗脫條件處理后的脫細(xì)胞基質(zhì)不僅可以保留組織或器官中的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分，而且可以使其中的血管系統(tǒng)及超微結(jié)構(gòu)的完整性得到一定保存，因此是一種適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織再生的優(yōu)良材料。脫細(xì)胞技術(shù)的迅猛發(fā)展掀起了脫細(xì)胞基質(zhì)的研究熱潮。自從2008年Ott等人首次成功制備出心臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)以來(lái)，研究人員已成功獲得了多種臟器的全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，如肝臟、腎臟、肺臟等。肝臟作為機(jī)體最大的臟器，，基于脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究已成為組織工程研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。目前，用于肝臟組織工程研究的脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料主要包括兩類(lèi)：非肝臟來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)材料和肝臟來(lái)源的全器官脫細(xì)胞基質(zhì)材料。 在基于非肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，為了拓寬支架材料的來(lái)源，國(guó)內(nèi)外研究人員致力于探索其他組織來(lái)源的非肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性。例如，研究人員已成功利用空腸脫細(xì)胞基質(zhì)材料構(gòu)建了工程化類(lèi)肝組織，研究發(fā)現(xiàn)空腸脫細(xì)胞基質(zhì)材料能夠支持肝細(xì)胞正常的形態(tài)及其代謝活性，表明非肝臟來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)材料能夠應(yīng)用于肝臟組織工程研究。目前，研究其他組織來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)材料對(duì)肝細(xì)胞的支持作用或構(gòu)建工程化肝臟組織已為成本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。 大網(wǎng)膜（greater omentum）是連接胃大彎至橫結(jié)腸的腹膜，富有極強(qiáng)的彈性和靈活性，同時(shí)具有高度血管化的結(jié)構(gòu)，這些特點(diǎn)使其成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中優(yōu)良的天然材料。目前，大網(wǎng)膜在臨床上主要用于外科重建手術(shù)中對(duì)炎性或者缺損組織的修復(fù)，促進(jìn)組織的再生；在組織工程研究領(lǐng)域，大網(wǎng)膜可作為體外移植構(gòu)建物的天然生物反應(yīng)器，促進(jìn)構(gòu)建物血管化的形成，增強(qiáng)移植構(gòu)建物的功能，已成功應(yīng)用于心肌組織工程、軟骨組織工程、神經(jīng)組織工程等領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著脫細(xì)胞技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員在大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)研究中開(kāi)展了大量研究工作，并成功獲得了大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，然而，目前尚未見(jiàn)將大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用于肝臟組織工程的研究報(bào)道。 在基于肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，研究人員已經(jīng)應(yīng)用胎兒肝細(xì)胞、原代肝細(xì)胞、肝細(xì)胞系等多種來(lái)源的細(xì)胞接種到肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)中，成功在體外構(gòu)建了具有一定功能的工程化肝臟組織或類(lèi)器官。研究發(fā)現(xiàn)，與以往的支架材料相比，肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)能夠?yàn)榧?xì)胞提供更接近于天然肝臟的微環(huán)境。此外，由于細(xì)胞外基質(zhì)成分在不同的物種之間具有高度保守性，脫細(xì)胞技術(shù)得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架同時(shí)具有低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)，因而可以作為工程化肝臟組織構(gòu)建中優(yōu)良的生物支架材料。 獲得結(jié)構(gòu)及組成均優(yōu)良的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)材料是開(kāi)展基于脫細(xì)胞基質(zhì)肝臟組織工程研究的基礎(chǔ)與前提。目前，肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法主要包括物理法、化學(xué)法、酶學(xué)消化法以及上述方法的組合使用等。然而，雖然脫細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展日新月異，涌現(xiàn)了許多脫細(xì)胞方法，但現(xiàn)有脫細(xì)胞洗脫方法均存在一定的不足，比如洗脫時(shí)間長(zhǎng)、ECM成分破壞嚴(yán)重、生長(zhǎng)因子大量丟失等。理想的制備肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的方法尚有待進(jìn)一步優(yōu)化。 基于上述分析，本論文主要從以下三個(gè)方面開(kāi)展研究工作： 第一部分：基于大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究 目的：研究大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的成分組成、生物相容性及其應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性。方法：利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)四種大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)（No.1、2、3、4）的組成，通過(guò)掃描電鏡檢測(cè)其形態(tài)與孔徑大小；在此基礎(chǔ)上，分別接種大鼠原代分離的肝細(xì)胞構(gòu)建工程化肝臟組織片層，并進(jìn)行肝臟組織工程研究，不同時(shí)間點(diǎn)取材，通過(guò)Live/Dead染色檢測(cè)細(xì)胞活性，利用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)工程化組織中肝細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)功能。結(jié)果：四種大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)均含有天然ECM中主要蛋白組分并具有典型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中No.1、3基質(zhì)孔徑較小，No.2、4基質(zhì)孔徑較大；肝臟組織工程研究發(fā)現(xiàn)，與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)支架可以更好的支持肝細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)及支持其糖原儲(chǔ)存、白蛋白分泌等生物學(xué)功能的發(fā)揮。結(jié)論：大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為一種優(yōu)良的生物支架材料，能夠維持肝細(xì)胞的形態(tài)并支持其生物學(xué)功能，在肝臟組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。 第二部分：肝臟全器官脫細(xì)胞支架材料的制備及條件優(yōu)化 目的：對(duì)兩種肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法進(jìn)行比較，以期篩選出更為有效的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法。方法：采用兩種不同方案（分別以十二烷基硫酸鈉（SDS）和Triton X-100+SDS（Tx+SDS）為主要洗滌劑）制備肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，通過(guò)組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法檢測(cè)基質(zhì)中細(xì)胞和核酸成分的去除情況、ECM蛋白組成及生長(zhǎng)因子含量。結(jié)果：兩種方法均能達(dá)到去細(xì)胞化要求；SDS方案得到的脫細(xì)胞基質(zhì)脈管網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散；Tx+SDS方案得到的脫細(xì)胞基質(zhì)脈管結(jié)構(gòu)完整，ECM蛋白和生長(zhǎng)因子含量均高于SDS方案。結(jié)論：利用Tx+SDS為主要洗滌的脫細(xì)胞方法可成功制備出優(yōu)良的肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)，為工程化肝臟組織構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：基于肝臟全器官脫細(xì)胞支架材料的肝臟組織工程研究 目的：探索以本研究中制備的肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)為支架材料，構(gòu)建工程化肝臟組織的可行性。方法：以Tx+SDS方案制備肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)，接種HepG2細(xì)胞系構(gòu)建工程化肝組織片層，體外培養(yǎng)7天后取材，利用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、PAS染色研究工程化肝組織的形態(tài)及其生物學(xué)功能。結(jié)果：組織學(xué)染色結(jié)果表明，肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)支架可以支持細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)，維持細(xì)胞形態(tài)和增殖能力；PAS染色結(jié)果顯示此支架材料能夠支持細(xì)胞糖原儲(chǔ)存生物學(xué)功能的發(fā)揮。結(jié)論：Tx+SDS方法制備的肝臟全器官脫細(xì)胞支架材料具有良好的生物相容性，可維持細(xì)胞形態(tài)并支持其生物學(xué)功能，能夠作為工程化肝臟組織構(gòu)建的優(yōu)良支架材料。 綜上所述，本論文在基于非肝臟來(lái)源脫細(xì)胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，系統(tǒng)比較了四種具有大小兩類(lèi)不同孔徑的大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)的成分組成，發(fā)現(xiàn)四種大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)均良好的保留有天然ECM主要蛋白成分且具有良好的生物相容性；與小孔徑支架材料相比，大孔徑大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)能夠更好的維持肝細(xì)胞形態(tài)并支持其糖原儲(chǔ)存、白蛋白分泌等生物學(xué)功能的發(fā)揮，證實(shí)了大網(wǎng)膜脫細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)用于肝臟組織工程的可行性，拓展了肝臟組織工程中脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的來(lái)源。在基于肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的肝臟組織工程研究方面，本論文首先比較研究了兩種制備肝臟全器官脫細(xì)胞基質(zhì)的洗脫方案，研究發(fā)現(xiàn)與SDS方案相比，Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)可以保留天然肝臟的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、脈管結(jié)構(gòu)完整性，并能更好的保留ECM基本組分。其次，以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)為支架材料構(gòu)建工程化肝臟組織，發(fā)現(xiàn)工程化組織中細(xì)胞能夠維持良好的形態(tài)并能夠發(fā)揮生物學(xué)功能，表明以Tx+SDS洗脫方案制備的肝臟脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的生物學(xué)性能，能夠作為工程化肝臟組織構(gòu)建優(yōu)良的支架材料。上述基于脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究有望為肝衰竭未來(lái)的臨床治療提供新的策略與手段。

  本文關(guān)鍵詞：基于脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料的肝臟組織工程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。