本文選題：創(chuàng)傷性腦水腫　切入點：氨甲酰化促紅細胞生成素　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)在全身的創(chuàng)傷性疾病中占有非常重要的地位，具有發(fā)病率較高、病情危重、預(yù)后差等特點，給整個社會與家庭均造成極大的經(jīng)濟和精神負擔(dān)。而顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷中均有不同程度的腦水腫存在，是顱腦創(chuàng)傷患者早期死亡或產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙，影響患者疾病預(yù)后重要原因。創(chuàng)傷性腦水腫的機制探索及新的、有效的神經(jīng)保護藥物的研發(fā)，一直是國內(nèi)外學(xué)者積極研究的重點和熱點。 近二十年大量的研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）不但可以促進紅細胞生成，而且有著非常有效的抗凋亡、抑制炎癥、促進組織再生修復(fù)等保護作用。而EPO相關(guān)衍生物——氨甲酰化促紅細胞生成素（carbamylated erythropoietin，C-EPO）更是保留了EPO廣泛、有效的神經(jīng)保護功能，又無促進紅細胞生成的副作用。C-EPO的發(fā)現(xiàn)，為尋找確切有效并且安全可靠的顱腦創(chuàng)傷神經(jīng)保護藥物提供了新方向。但目前，C-EPO是否能減輕創(chuàng)傷后腦水腫及其具體分子機制，國內(nèi)外尚無深入研究及報道。 本研究擬在建立穩(wěn)定可靠的SD大鼠重型顱腦創(chuàng)傷模型、體外氧糖剝奪/復(fù)氧星形膠質(zhì)細胞水腫模型的基礎(chǔ)上，①觀察C-EPO對大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦水腫、神經(jīng)功能、水腫相關(guān)蛋白（水通道蛋白4，aquaporin4，AQP4）和信號通路（蛋白激酶C，protein kinase C，PKC）等的影響，從行為學(xué)，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等多方面探討C-EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的作用及可能參與的機制；②在體外實驗，進一步觀察C-EPO對氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞水腫、AQP4及PKC信號通路等的影響，從細胞形態(tài)學(xué)，超微結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)等多方面深入探討驗證C-EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的具體分子機制。 本研究共分四個部分： 第一部分：氨甲�；偌t細胞生成素對大鼠創(chuàng)傷性腦水腫的影響 目的：通過觀察C-EPO對大鼠急性重型腦外傷后腦水腫和大鼠神經(jīng)功能的影響，旨在研究其是否有抑制創(chuàng)傷性腦水腫的保護作用。 方法：168只SD大鼠隨機分為四組：正常組，假手術(shù)組，腦創(chuàng)傷組，C-EPO治療組。大鼠重型TBI模型造模成功后每天采用腹腔注射100ug/kg的C-EPO或者等體積生理鹽水，于傷后6h、24h、3d和7d獲取腦組織；采用mNSS觀察大鼠神經(jīng)功能損傷及恢復(fù)情況；干濕重法檢測腦組織含水量；E-B法檢測血腦屏障通透性變化；HE染色檢測傷灶腦組織病理變化。 結(jié)果：①腦含水量：C-EPO治療組大鼠的腦含水量在第6h和1、3d時較腦創(chuàng)傷組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。②EB染色：C-EPO治療組大鼠腦EB含量較腦創(chuàng)傷組大鼠傷后1、3d時明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③H E染色：rhEPO組與腦創(chuàng)傷組比較，神經(jīng)細胞水腫減輕，傷灶中心神經(jīng)細胞受損及壞死區(qū)縮小。④mNSS評分：C-EPO治療組的mNSS評分較腦創(chuàng)傷組在傷后3、7和14d時出現(xiàn)顯著性降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。 結(jié)論：C-EPO能顯著減輕大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后腦水腫，降低血腦屏障通透性，改善大鼠創(chuàng)傷后神經(jīng)功能的障礙。初步證實了C-EPO對重型顱腦損傷后腦水腫有明顯的抑制保護作用。 第二部分：C-EPO對大鼠顱腦創(chuàng)傷后PKC信號通路酸化和AQP4表達的影響 目的觀察C-EPO對SD大鼠急性重型腦外傷后傷灶周邊PKC磷酸化及AQP4表達水平的影響，旨在研究探討其抑制創(chuàng)傷性腦水腫保護作用的潛在分子機制。 方法168只SD大鼠隨機分為四組：正常組，假手術(shù)組，腦創(chuàng)傷組，C-EPO治療組。采用RT-PCR法，檢測大鼠急性重型TBI后傷灶周邊腦組織中AQP4mRNA的表達水平；用Western Blot法，檢測PKC的磷酸化水平和AQP4蛋白的表達水平；用組織免疫熒光染色法，檢測傷灶周邊腦組織中AQP4蛋白的表達水平。 結(jié)果①Real-time PCR：腦創(chuàng)傷組傷灶周邊腦組織中AQP4mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）；C-EPO治療組AQP4mRNA的表達水平在傷后6h和1、3d時較腦創(chuàng)傷組均明顯降低（P＜0.05）。②WesternBlot法：腦創(chuàng)傷組AQP4蛋白的表達在創(chuàng)傷后出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），C-EPO治療組AQP4蛋白在傷后第1、3和7d時較腦創(chuàng)傷組表達明顯降低，（P＜0.05）。PKC磷酸化水平在傷后有明顯下降（P＜0.05），C-EPO治療可以顯著升高創(chuàng)傷后PKC磷酸化的水平（P＜0.05）。③免疫熒光：腦創(chuàng)傷組AQP4蛋白的熒光表達均較假手術(shù)組明顯升高，C-EPO治療組AQP4蛋白的熒光表達明顯低于腦創(chuàng)傷組。 結(jié)論大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后PKC磷酸化水平出現(xiàn)顯著下降，同時AQP4的表達明顯增高；C-EPO治療能顯著提高傷后PKC的磷酸化水平，降低顱腦創(chuàng)傷后AQP4的高表達水平。本部分結(jié)果充分提示AQP4及PKC信號通路參與了C-EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的神經(jīng)保護作用。 第三部分：C-EPO對星形膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復(fù)氧后細胞水腫的影響 目的通過觀察C-EPO對體外原代星形膠質(zhì)細胞在氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygeneglucose deprivation and reoxygenation，OGD/R）后細胞水腫及損傷情況的影響，旨在研究C-EPO是否能夠減輕氧糖剝奪/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細胞水腫。 方法體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，并隨機分為正常組、OGD/R損傷組和C-EPO治療組。建立氧糖剝奪/復(fù)氧細胞水腫模型，使用C-EPO（10ng/ml）預(yù)處理星形膠質(zhì)細胞。在氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后0.5h，2h，8h和24h時，用光學(xué)顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化，電子顯微鏡觀察線粒體等超細胞微結(jié)構(gòu)變化，[3H]-3-氧-甲基-D-葡萄糖攝法測定細胞體積變化，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出率檢測細胞損傷及恢復(fù)情況。 結(jié)果①光學(xué)顯微鏡： C-EPO治療組星形膠質(zhì)細胞在傷后胞體及足突的腫脹情況較OGD/R損傷組明顯減輕。②電子顯微鏡：C-EPO預(yù)處理后細胞線粒體腫脹及溶酶體增高等情況明顯緩解。③細胞體積：星形膠質(zhì)細胞在氧糖剝奪/復(fù)氧后體積明顯增加（P＜0.05），C-EPO預(yù)處理組的細胞體積明顯低于OGD/R損傷組（P＜0.05）。④LDH漏出率：給予C-EPO預(yù)處理后細胞在氧糖剝奪/復(fù)氧后的LDH漏出率較OGD/R損傷組明顯降低（P＜0.05）。 結(jié)論本部分實驗結(jié)果證實了C-EPO預(yù)處理能明顯減輕體外氧糖剝奪/復(fù)氧損傷引起的星形膠質(zhì)細胞水腫，減輕細胞線粒體腫脹等超微結(jié)構(gòu)的改變。以上實驗提示C-EPO能夠抑制顱腦創(chuàng)傷后缺血再灌注引起的星形膠質(zhì)細胞水腫。 第四部分：C-EPO對氧糖剝奪/復(fù)氧后水腫星形膠質(zhì)細胞中PKC磷酸化和AQP4的表達的影響 目的觀察C-EPO及PKC阻斷劑（H-7）對氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞水腫、PKC磷酸化及AQP4的表達的影響，旨在研究C-EPO是否是通過調(diào)節(jié)PKC信號通路磷酸化，降低AQP4表達水平，以減輕氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞水腫。 方法將細胞隨機分為正常組、OGD/R損傷組、C-EPO組和C-EPO+H-7組。用Western Blot法，檢測氧糖剝奪/復(fù)氧后各組細胞PKC的磷酸化水平和胞膜AQP4蛋白的表達水平；用細胞免疫熒光雙標染色法，檢測細胞AQP4蛋白的表達水平；用RT-PCR法檢測相應(yīng)細胞AQP4mRNA的表達水平；測定各組細胞體積和LDH漏出率的變化。 結(jié)果OGD/R損傷組細胞PKC磷酸化水平在氧糖剝奪/復(fù)氧后明顯下降（P＜0.05），同時胞膜AQP4mRNA和蛋白的表達水平顯著升高，（P＜0.05）；C-EPO治療組后細胞PKC磷酸化的水平明顯回升（P＜0.05），胞膜AQP4的表達水平也顯著下降（均P＜0.05）。與C-EPO組相比，C-EPO+H-7組胞膜AQP4的表達水平則出現(xiàn)明顯升高，細胞體積及LDH漏出率明顯增加（均P＜0.05）。 結(jié)論本部分實驗證實了C-EPO可通過提示氧糖剝奪/復(fù)氧后PKC信號通路的磷酸化水平，抑制AQP4的高表達，減輕氧糖剝奪/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細胞水腫，證實了PKC信號通路和AQP4在C-EPO抑制創(chuàng)傷腦水腫中發(fā)揮了重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R651.15

【共引文獻】

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本文編號：1584805